【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸样本检测领域，特别涉及一种文库污染检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、随着生物技术的高速发展，人们已经充分认识到核酸是关键的遗传物质，因此以检测核酸突变为目的的检测方法层出不穷，并且广泛的应用于生命科学检测的各个领域，包括单核苷酸多态性（snp），hla，疾病的诊断与预测等，针对不同的检测目的，存在着多种多样的检测方法，而不同的检测方法之间其检测性能存在一定的差异。
2、目前常用的snp分型技术主要为基于荧光定量pcr的snp分型技术、基于探针捕获的snp分型技术、基于飞行质谱的snp分型技术等；不同snp分型技术的检测性能存在差异。1）基于荧光定量pcr的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计荧光引物，通过荧光信号产生的曲线，完成snp分型进而对实验过程中污染物的状态进行确定，该实验方法检测的灵敏度较高，但是由于该实验方法本身的局限性，无法对10个以上的snp位点同时进行检测，超过10个需分管进行检测，实验成本及周期均不可控，影响该技术在临床上的应用；2）基于荧光定量pcr的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计荧光引物，通过荧光信号产生的曲线，完成snp分型进而对实验过程中污染物的状态进行确定，该实验方法检测的灵敏度较高，但是由于该实验方法本身的局限性，无法对10个以上的snp位点同时进行检测，超过10个需分管进行检测，实验成本及周期均不可控，影响该技术在临床上的应用；3）基于探针捕获的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计捕获探针，探针设计完成之后混合为捕获panel，通过
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种文库污染检测试剂盒及检测方法。
2、鉴于现有技术中的这些问题，为了缩短检测流程提高检测效率，节省检测成本，增加检测结果的准确性，本方法直接以文库为模板使用多重不对称pcr的实验方式对不同的snp区域进行扩增，优化实验过程中文库构建及目标区域捕获等试验环节，大大提高了实验效率；同时多重不对称pcr的扩增技术中，只有一条特异性扩增引物，以及一条通用扩增引物在反应体系中参与实验，因此目的区域的产物的产量呈现线性增长，与传统的多重pcr相比在扩增的均一性上表现更加优异。
3、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
4、本专利技术是关于一以分子检测平台生产的文库为模板，然后通过多重不对称pcr扩增直接获得多种带标记的基因标志物；基因标志物通过二代测序获得相应的snp位点信息，通过对特异性snp位点的分析实现对实验中的样本交叉污染比例进行鉴定的技术。
5、本专利技术的多重不对称pcr扩增体系中包含多条扩增引物，其中通过调节上游特异性引物和下游通用引物保持不同的投入比例来实现同时扩增多个目标基因，且得到的目标基因产物为线性增长。特别地，对上游特异性引物的5’端进行生物素（biotin）修饰，使得到的单链目标基因能与相应的链霉亲和素（streptavidin，简称sa）修饰的磁珠形成“biotin-sa”结合，可进一步对目标扩增区域进行富集。
6、本专利技术的多重不对称pcr通过抗抑制剂的dna聚合酶，以构建好的文库为扩增模板，将多个上游特异性引物按照等摩尔进行混合组成的上游引物池与下游通用引物和dntp等集中在一个反应槽，通过温度控制实现直接pcr。其中，所述pcr反应体系和反应条件如表2和表3所示。
7、本专利技术的多重不对称pcr，通过多个上游特异性引物按照等摩尔进行混合组成的上游引物池与下游通用引物对待检测生物样本的文库产物进行pcr扩增。特别地，所需目标基因单链由上游特异性引物延伸所得，上游特异性引物的添加量与下游通用引物的添加量需调整为合适的比例，使得目标区域的pcr产物为单链dna，其中上游特异性引物与下游通用引物的比例为1：10-1：100；优选为1：50。
8、本专利技术提供的检测方法包括：模板文库到目标基因扩增的过程，和目的区域二次富集的过程（具体参见图5）。
9、具体来说，本专利技术如下所述：
10、本专利技术的第一方面，提供了一种多重不对称pcr联用链霉亲和素磁珠捕获并对目标基因的snp位点进行验证的方法，所述方法包括以下步骤：
11、（1）获取待检测生物样本的文库产物；
12、（2）通过多重不对称pcr扩增获得带标记的单链基因标志物；
13、（3）对单链基因标志物进行杂交实验，实现目标区域的富集；
14、（4）经过普通pcr扩增补齐完整文库结构，获得目标文库；
15、（5）将目标文库进行二代测序。
16、在本专利技术第一方面所述方法中，所述步骤（1）的具体操作如下：将待检测生物样本的基因组dna完成文库构建，具体操作步骤参考诺唯赞dna文库构建试剂盒说明书，文库产物作为步骤（2）中多重不对称pcr扩增的模板；所述文库质量标准为文库生产平台标准；具体为华大t7测序平台标准。
17、优选的，所述生物样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种。
18、优选的，所述哺乳动物为人和小鼠中的至少一种。
19、优选的，所述基因组dna为人类全血基因组dna。
20、在本专利技术第一方面所述方法中，所述步骤（2）的具体操作如下：将步骤（1）中经过预处理好的文库样本、hifi hot start mix、带有标记物的上游引物、下游引物，进行多重不对称pcr扩增。
21、优选的，所述hifi hot start mix包含dna聚合酶，mgcl2，dntp。
22、优选的，所述上游引物中带有的标记物为生物素，所述pcr缓冲液中mgcl2和dntp的浓度分别为1-4mm（进一步为1.5mm）和0.1-0.3mm（进一步为0.2 mm）。在一些具体的实施方式中，上文所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的摩尔浓度比为1：10-1：100；优选为1：50-1：100；进一步优选的，所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的摩尔浓度比为1：50。
23、在本专利技术第一方面所述方法中，所述步骤（3）的具体操作如下：将步骤（2）中扩增得到的带标记的单链基因标志物与链霉亲和素磁珠进行杂交，杂交结束后洗去未结合的dna片段，将目标扩增区域进一步纯化。
24、优选的，所述杂交温度为65℃，所述杂交时间为45min。
25、在本专利技术第一方面所述方法中，所述步骤（4）的具体操作如下：将步骤（3）中富集产物进行普通pcr扩增补齐完整文库结构，并进一步纯化，获得目标文库。
26、在本专利技术第一方面所述方法中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种目标文库污染的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述生物样本来源于哺乳动物、植物和微生物的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：多重不对称PCR上游引物池中各引物浓度≤4µM；所有上游引物在5’端添加biotin修饰；上游引物与下游引物需按照一定配比进行反应，其中上游引物：下游引物比例≥1：100。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：多重不对称PCR上游引物池中各引物浓度为50nM-4µM；上游引物与下游引物需按照一定配比进行反应，其中上游引物：下游引物比例为1：10-1：100。
6.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：上游引物中的特异性扩增目标SNP的序列长度为18-30nt，部分文库接头序列长度为20-30nt；
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：上游引物中的特异性扩增目标SNP的序列长度为18-22nt，部分文库接头序列长度为2
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：上游引物的序列如SEQ ID NO.1-20所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.21所示；
9.一种权利要求1-8任一项所述检测方法中所述的目标文库的构建方法。
10.一种目标文库构建的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-8任一项所述检测方法中所述的扩增引物。
...【技术特征摘要】
1.一种目标文库污染的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述生物样本来源于哺乳动物、植物和微生物的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：多重不对称pcr上游引物池中各引物浓度≤4µm；所有上游引物在5’端添加biotin修饰；上游引物与下游引物需按照一定配比进行反应，其中上游引物：下游引物比例≥1：100。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：多重不对称pcr上游引物池中各引物浓度为50nm-4µm；上游引物与下游引物需按照一定配比进行反应，其中上游引物：下游引物比例为1：10-1：1...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，陈天达，罗影涛，冯丽华，周庆芳，
申请(专利权)人：广州嘉检医学检测有限公司，
类型：发明
国别省市：
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