【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种fcgr2a基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。
技术介绍
1、川崎病（kawasaki disease，kd）又可称之为皮肤黏膜淋巴结综合征，常发生于5岁以下的儿童。川崎病病因不明，目前认为是由遗传因素、感染和免疫的复杂相互作用的结果，可并发冠状动脉病变（coronary artery lesions，cal），川崎病导致的cal是现阶段导致发达国家儿童罹患后天性心脏病的主要病因[1]。根据相关研究报道显示，在川崎病发病的早期阶段，若未采取积极有效的干预方式，15%-25%的患儿均会同时并发冠状动脉扩张，引发冠状动脉瘤[2]。
2、川崎病的诊断依据通常是具有发热症状，以及具有以下至少4项临床表现：双侧球结膜充血、口唇干红，草莓舌，口腔部粘膜弥漫性充血、皮疹、急性期手足发红、肿胀，恢复期甲周脱皮、非化脓性颈部淋巴肿大。但是有些患儿的临床表现少于4项，即不完全川崎病。这类患儿的诊断比较困难，很容易贻误治疗时期，从而引发cal。因此对川崎病并发cal相关基因的检测有助于对川崎病并发cal的预后和风险评估。
3、目前的研究报道了多个川崎病并发cal的相关基因，提示预后和风险评估。其中fcgr2a（fc fragment of igg receptor iia）编码igg受体家族中的fcγrⅱa。该基因编码的蛋白质是一种在巨噬细胞和中性粒细胞等吞噬细胞上发现的细胞表面受体，参与吞噬和清除免疫复合物的过程，与自身免疫和感染性疾病相关。研究表明fcgr2a是kd的易感基因，其
4、人基因组中的fcgr2a基因的snp位点rs1801274属于单核苷酸位点的多态性。单核苷酸多态性（snp）全称single nucleotide polymorphisms，是指在基因组等位基因上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。常用snp分析方法有pcr-测序法、sanger测序法、高通量测序技术、pcr-芯片杂交法、突变扩增系统（amplification refractory mutation system，arms）等。这些分析方法中，直接测序的方法时间周期较长，不能及时为医生提供指导；芯片法成本高，使应用受到一定限制。
5、鉴于此，特提出本专利技术。
6、参考文献：
7、[1] 中华医学会儿科学分会心血管学组, 中华医学会儿科学分会风湿学组, 中华医学会儿科学分会免疫学组, 等. 川崎病诊断和急性期治疗专家共识. 中华儿科杂志,2022, 60(1):6-13.
8、[2] shuman s t, rowley a h. kawasaki disease：insightsintopathogenesis and approaches to treatment [j]. nat rev rheumatol, 2015,11(8)：475-482.
9、[3] duan et al. a genetic variant rs1801274 in fcgr2a as a potentialriskmarker for kawasaki disease: a case-control study and meta-analysis. plosone, 2014;9(8):e103329.
10、[4] 纪玉晓 等.川崎病患儿fcgr2a基因单核苷酸多态性的研究.中国当代儿科杂志,2013,15(03):196-200.
11、[5] yan et al. combined analysis of genome-wide-linked susceptibilitylocito kawasaki disease in han chinese. hum genet 132, 669-680, 2013。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种fcgr2a基因检测引物探针组合、试剂盒以及应用。
2、目前市场上还没有有关人fcgr2a基因多态性检测试剂盒，本产品基于实时荧光pcr技术，采用扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system，arms），实现口腔脱落细胞样本或全血样本中fcgr2a基因的snp位点rs1801274的分型。
3、本专利技术针对fcgr2a基因rs1801274位点设计特异性位点检测引物。对于fcgr2a基因a位点，pcr扩增时，由于fcgr2a基因aa引物3'末端的碱基与fcgr2a基因a位点的模板完全配对，引物延伸并对fcgr2a基因a位点的模板进行扩增，而与fcgr2a基因g位点的模板由于不能完全配对，引物的延伸被阻断，fcgr2a基因g位点的模板扩增被抑制，对于fcgr2a基因g位点的扩增反之。从而实现fcgr2a基因的分型。
4、并且fcgr2a基因的探针为cy5荧光标记，内源性内标基因（人类管家基因）为vic荧光标记，通过不同的荧光标记可实现在同一管中进行3重反应。通过内标可以对待测样本的采集、核酸提取、pcr检测全过程实行监控。另外，本产品添加了防污染组分ung酶，其作用机理是选择性水解断裂含有du的双链或者单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的dna链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。
5、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
6、本专利技术的第一方面提供一种引物探针组合，所述引物包括：选自核苷酸序列如seqid no：1所示的上游引物，核苷酸序列如seqid no：2所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的a位点；选自核苷酸序列如seq id no：4所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no：5所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的g位点；
7、所述探针包括seq id no：3和seq id no：6所示的检测探针；seq id no：3用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的a位点；seq id no：6用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的g位点。
8、在一些实施方式中，所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。
9、在一些实施方式中，所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。
10、在一些实施方式中，所述内参引物的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如seqid no：7和seq id no：8所示；所述内参探针的核苷酸序列如seq id no：9所示。
11、另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与seq id no：1～9所示的引物或探本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物探针组合，其特征在于：所述引物包括：选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物，用于检测FCGR2A基因rs1801274位点的A位点；选自核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示的下游引物，用于检测FCGR2A基因rs1801274位点的G位点；
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引物的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
5.根据权利要求2～4任一项所述的引物探针组合，其特征在于：所述探针为自身淬灭探针，且所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。
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7.含有权利要求1～5任一项所述的引物探针组合的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、UNG 酶、DNA聚合酶、阳性质控品、阴性质控品、防腐剂以及水中的至少一种。
...【技术特征摘要】
1.引物探针组合，其特征在于：所述引物包括：选自核苷酸序列如seq id no：1所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no：2所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的a位点；选自核苷酸序列如seq id no：4所示的上游引物，核苷酸序列如seq id no：5所示的下游引物，用于检测fcgr2a基因rs1801274位点的g位点；
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述引物还包括内参引物，所述探针还包括内参探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引物和所述内参探针用于定量检测人管家基因的核酸片段的表达。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于：所述内参引...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，龙敏明，滕梅芳，梁燕锋，
申请(专利权)人：广州嘉检医学检测有限公司，
类型：发明
国别省市：
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