【技术实现步骤摘要】
本申请涉及核酸检测领域，具体地，涉及一种荧光纳米探针及其制备方法，以及一种检测肠道益生菌的方法。
技术介绍
1、嗜酸乳杆菌是肠道中重要的益生菌之一，属于一种革兰氏阳性杆菌，定植于肠道内，可以释放乳酸、乙酸以及一些抗菌素，抑制不良微生物的增殖，调节菌群平衡，促进肠道健康。此外，在某些酸奶制品中也有添加，可以帮助失调的肠道环境恢复正常，具有很好的营养保健作用。探索新的嗜酸乳杆菌检测方法以及研究其在肠道原始位点的分布情况对其发挥健康功效的机理机制研究具有重要意义。
2、核酸适配体是利用体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸序列。具有靶标范围广、特异性和亲和力高、分子量小、环境耐受性好、可化学合成、易于化学修饰、免疫源性小等优点。通过化学合成与修饰将光学信号元件修饰到核酸适配体上即可成为光学核酸适配体探针，通过检测适配体与靶标物质发生识别后引起的光学变化信号来检测相应的待测物质。核酸适配体探针的基本组成可分为靶向部分、信号分子以及连接靶向配体和信号分子的连接物。
3、纳米金是一类制备简单，光学性质优良的纳米材料，其大小、形状、表面改性方式等不同可以赋予其不同的功能。比如可以基于荧光或表面增强拉曼等原理构建探针实现多种靶标物质的检测，但金属纳米材料也具有一定的局限性。比如在体内的生物相容性问题受到争议，因此采用生物相容性好的聚合物材料对其进行表面修饰，从而在体内相关研究中具有潜在的应用前景。果胶富含于植物细胞壁，柑橘皮、苹果皮、葡萄皮以及甜菜渣等植物细胞是其主要来源，其分子侧链含有
技术实现思路
1、本公开的目的在于为体内原始位点的肠道益生菌检测提供一种有效的技术手段，为了实现上述目的，本公开采用纳米金颗粒、修饰荧光染料的肠道益生菌核酸适配体以及其互补序列构建出性能优良的生物探针开展肠道益生菌的检测。
2、一方面，本公开提供了一种荧光纳米探针，所述荧光纳米探针含有第一靶向分子、第二靶向分子、第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒；
3、所述第一靶向分子为荧光染料修饰的巯基化的适配体，所述第二靶向分子为巯基化的适配体的cdna；
4、所述适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述适配体的cdna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、可选地，所述荧光纳米探针中还包括第一多糖和第二多糖，依次包覆于所述荧光纳米探针外层，得到多糖包覆的所述荧光纳米探针；
6、所述第一多糖为壳聚糖；所述第二多糖为选自果胶、淀粉和纤维素中的任意一种；本公开中在荧光纳米探针外层依次修饰有第一多糖和第二多糖，基于第一多糖与第二多糖的静电相互作用显著提升了探针的荧光稳定性，为体内原始位点的肠道益生菌的检测提供了一种有前景的新的技术手段并有希望为其发挥健康功效的机制研究提供更为直观的依据。
7、可选地，所述第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒为选自金纳米星、金纳米棒、金纳米笼、金纳米花、金纳米双锥和金纳米球中的任意一种；优选地，所述第一金纳米颗粒为金纳米球，所述第二金纳米颗粒为金纳米星；
8、所述荧光染料包括cy3、cy5、cy7和吲哚菁绿中的任意一种。
9、另一方面，本公开提供了一种制备荧光纳米探针的方法，该方法包括以下步骤：
10、s1、将第一靶向分子与第一金纳米颗粒共价连接，得到第一溶液；
11、s2、将第二靶向分子与第二金纳米颗粒共价连接，得到第二溶液；
12、s3、将所述第一溶液与所述第二溶液混合，进行第一孵育、离心洗涤后重新分散于缓冲液中，得到所述荧光纳米探针；
13、所述第一靶向分子为荧光染料修饰的巯基化的适配体，所述第二靶向分子为巯基化的适配体的cdna；
14、所述适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述适配体的cdna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
15、可选地，所述方法还包括：使用硫醇类还原剂对所述第一靶向分子进行活化，然后将活化后的第一靶向分子与所述第一金纳米颗粒共价连接；
16、所述硫醇化还原剂包括tcep（三(2-羧乙基)膦）、dtt（二硫苏糖醇）、dte（二硫赤藓醇）中的至少一种；
17、所述缓冲液优选为tris-hcl缓冲液。
18、可选地，所述第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒为选自金纳米星、金纳米棒、金纳米笼、金纳米花、金纳米双锥和金纳米球中的任意一种；所述第一金纳米颗粒和所述第二金纳米颗粒的尺寸为20-60nm；
19、优选地，所述第一金纳米颗粒为金纳米球，所述第二金纳米颗粒为金纳米星；
20、所述荧光染料包括cy3、cy5、cy7和吲哚菁绿中的任意一种。
21、可选地，所述方法还包括：将所述荧光纳米探针依次与含有第一多糖的溶液和含有第二多糖的溶液均匀混合，得到多糖包覆的所述荧光纳米探针；
22、所述第一靶向分子、所述第一金纳米颗粒、所述第二靶向分子、所述第二金纳米颗粒、所述第一多糖、所述第二多糖和所述缓冲液的重量比为1：（10-1000）：（1-10）：（10-1000）：（10-200）：（10-200）：（100000-800000）。
23、可选地，所述第一孵育的条件包括：在35-40℃条件下孵育8-12小时；
24、所述离心洗涤的条件包括：在4000-5000rpm、4-6min条件下离心洗涤3-5次；
25、所述混合的条件包括：25-40℃、400-1000rpm下磁力搅拌10-14h。
26、所述第一多糖为壳聚糖；所述第二多糖为选自果胶、淀粉和纤维素中的任意一种。
27、另一方面，本公开提供了一种检测肠道益生菌的方法，所述方法包括：
28、将上述荧光纳米探针或上述方法制备得到的荧光纳米探针与可能含有目标菌的待测溶液进行第二孵育，然后测定荧光强度。
29、可选地，所述第二孵育的条件包括：在35-40℃条件下孵育1-3h；
30、所述肠道益生菌包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌中的至少一种。
31、通过上述技术方案，本公开提供了一种荧光纳米探针，在金纳米颗粒表面连接上修饰了荧光染料cy3的核酸适配体，在另一金纳米颗粒表面连接其互补序列，基于dna双链杂交构建探针，将该荧光纳米探针加入含有目标菌的待测溶液中，核酸适配体趋向于与目标菌结合，双链打开，荧光强度发生改变，从而实现嗜酸乳杆菌的定量检测，具有良好的线性，且特异性好、检测灵敏度高，检测限低至1cfu/ml。
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1.一种荧光纳米探针，其特征在于，所述荧光纳米探针含有第一靶向分子、第二靶向分子、第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒；
2.根据权利要求1所述的荧光纳米探针，其中，所述荧光纳米探针中还包括第一多糖和第二多糖，依次包覆于所述荧光纳米探针外层，得到多糖包覆的所述荧光纳米探针；
3.一种制备荧光纳米探针的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括：使用硫醇类还原剂对所述第一靶向分子进行活化，然后将活化后的第一靶向分子与所述第一金纳米颗粒共价连接；
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒为选自金纳米星、金纳米棒、金纳米笼、金纳米花、金纳米双锥和金纳米球中的任意一种；所述第一金纳米颗粒和所述第二金纳米颗粒的尺寸为20-60nm；
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括：将所述荧光纳米探针依次与含有第一多糖的溶液和含有第二多糖的溶液均匀混合，得到多糖包覆的所述荧光纳米探针；
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一孵育的条件包括
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一多糖为壳聚糖；所述第二多糖为选自果胶、淀粉和纤维素中的任意一种。
9.一种检测肠道益生菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第二孵育的条件包括：在35-40℃条件下孵育1-3h；
...【技术特征摘要】
1.一种荧光纳米探针，其特征在于，所述荧光纳米探针含有第一靶向分子、第二靶向分子、第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒；
2.根据权利要求1所述的荧光纳米探针，其中，所述荧光纳米探针中还包括第一多糖和第二多糖，依次包覆于所述荧光纳米探针外层，得到多糖包覆的所述荧光纳米探针；
3.一种制备荧光纳米探针的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法还包括：使用硫醇类还原剂对所述第一靶向分子进行活化，然后将活化后的第一靶向分子与所述第一金纳米颗粒共价连接；
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一金纳米颗粒和第二金纳米颗粒为选自金纳米星、金纳米棒、金纳米笼、金纳米花、金纳米双锥和...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑金铠，杨彩怡，赵成英，冯丽萍，陈钰莹，王凤章，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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