【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法和应用，属于生物分析。
技术介绍
1、piwi相互作用rna(pirna)是一种长度为24-31个核苷酸的小型非编码rna，通过抑制转座子活性来维持基因组完整性。此外，pirna广泛参与多种生理过程，包括rna沉默、mrna周转、端粒保护，和表观遗传学调控。pirna的异常表达可能损害基因组稳定性，并与多种癌症的发生密切相关，包括肾癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌。即使在复杂的生物基质中，pirna 3′端的2′-o-甲基化修饰也可以保护pirna不被降解或氧化，这使得pirna成为非常可靠和有前景的癌症生物标志物。因此，pirna的检测对癌症的基础研究和诊断具有很高的价值。微阵列和northern印迹适用于pirna检测，但它们存在洗涤和分离程序费力、样品消耗大、结果半定量、特异性差和灵敏度有限等问题。
2、聚合酶链式反应能够高灵敏度地定量pirna，但需要复杂的逆转录步骤才能将pirna转化为互补dna。另外，已经报道了几种基于光电化学和荧光检测的新方法用于pirna检测，荧光法由于其快速、简单和高灵敏度的突出优点而更加流行。这些荧光pirna测定通常使用有机染料(例如，黑洞猝灭剂2、黑洞猝灭剂1、cy3、cy5和cy5.5)来构建荧光猝灭探针，其具有低量子产率、差光稳定性和小斯托克斯位移的局限性，并且由于光谱干扰和不完全荧光猝灭可能产生非特异性结果。
3、半导体量子点(qd)是一种新型荧光纳米材料，具有高量子产率、窄而对称的发射、高亮度、良
技术实现思路
1、技术问题：本专利技术的目的是提供一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法和应用，该方法具有单碱基辨别能力和单细胞敏感性，可进一步应用于测定pirna在不同细胞系中的表达水平，以及临床癌症和健康组织中pirna水平的区分，为pirna相关的生物医学研究、药物发现提供了一个简单而强大的平台。
2、技术方案：piwi相互作用rna(pirna)是一种小型非编码rna，对维持基因组完整性至关重要。异常的pirna水平与多种癌症密切相关，使其成为癌症研究和检测的有前途的生物标志物。然而，已报道的pirna检测往往存在采购费力、特异性差、样品消耗量大和灵敏度不令人满意的问题，这使得它们难以在实际临床应用中应用。在此，开发了一种用于简单、灵敏和选择性定量pirna的催化单量子点纳米传感器。在这种纳米传感器中，pirna信号可以通过t4 rna连接酶2特异性识别并连接探针a和探针b后，实现ssdna信号转移。得到的探针ab可以触发扩增酶dna连接酶催化的cy5标记的报告探针c和生物素标记的报告探针d的连接，形成探针cd。探针cd反过来促进新探针a和b的连接。因此，可以实现指数信号放大，产生大量cy5-和生物素标记的探针cd。这些探针cd可以组装在605qd表面上，以诱导有效的förster共振能量转移信号。由于连接反应的高保真度、高效的指数信号放大和先进的单分子荧光检测，该纳米传感器具有单碱基识别能力和高灵敏度，检测极限为104am，它可以准确灵敏地定量不同细胞系甚至临床组织样本中的内源性pirna，为pirna相关的生物医学和临床研究提供了一个新的平台。
3、本专利技术的检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法具体步骤如下：
4、步骤1，pirna与t4 rna连接酶2缓冲液、探针a、探针b、t4 rna连接酶2和atp反应，得到反应产物；
5、其中，pirna是与piwi蛋白相互作用的核糖核酸；
6、t4 rna连接酶2是一种可以催化单链核糖核酸、单链脱氧核糖核酸或单核苷酸分子间或分子内5'磷酸基末端与3'羟基末端之间形成磷酸二酯键的酶；
7、t4 rna连接酶2缓冲液为t4 rna连接酶2产品中自带的反应缓冲液；
8、atp是腺嘌呤核苷三磷酸；
9、步骤2，将步骤1的反应产物加入含有ampligase缓冲液、探针c和探针d以及ampligase的反应体系，连接链反应进行热循环，得到连接产物；
10、其中，ampligase是一种扩增连接酶；
11、ampligase缓冲液为ampligase产品中自带的反应缓冲液；
12、步骤3，将605qds与步骤2得到的连接产物在含有1×qd缓冲液的溶液中混合，在室温下孵育15min后得到量子点纳米传感器，即可进行后续测量；
13、其中，605qd是最大发射波长在605nm的半导体量子点。
14、所述t4 rna连接酶2缓冲溶液包括tris-hcl、mgcl2、dtt。
15、所述ampligase缓冲溶液包括tris-hcl,kcl,mgcl2,nad,x-100。
16、所述qd缓冲溶液包括tris-hcl,mgcl2,(nh4)2so4。
17、所述pirna序列为：ggc ccc aug gug uaa ugg uca gca cuc。
18、所述探针a序列为：gtg ctg acc at/ru/ra。
19、所述探针b序列为：p-cac cat ggg gc。
20、所述探针c序列为：cy5-ggc ccc atg gtg。
21、所述探针d序列为：p-taa tgg tca gca ctc-biotin。
22、采用本专利技术方法制备的量子点纳米传感器的应用为：所述量子点纳米传感器用于基于连接介导的指数放大单量子点纳米传感器的催化组装用于癌症组织中piwi-相互作用rna的灵敏检测法的应用，应用于灵敏地检测pirna，最低检测限达到104am；与基于dna四面体探针的荧光方法相比，所提出的纳米传感器的灵敏度提高了6个数量级，与基于滚圈扩增的荧光分析相比，灵敏度提高了2个数量级。
23、有益效果：在这种纳米传感器中，pirna信号可以通过t4 rna ligase 2特异性识别并连接探针a和探针b后，实现ssdna信号转移。所得的ssdna可以通过扩增酶dna连接酶催化的报告探针c和探针d的环连接来触发指数信号扩增。因此，产生了大量的探针cd，其可以组装在qd表面上，以均匀的方式诱导有效的fret信号，消除了微阵列、northern印迹、和光电化学等方法测定pirna中涉及的任何分离和洗涤程序。此外，由于连接反应的高保本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述T4 RNA连接酶2缓冲溶液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT。
3.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述Ampligase缓冲溶液包括Tris-HCl,KCl,MgCl2,NAD,X-100。
4.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述QD缓冲溶液包括Tris-HCl,MgCl2,(NH4)2SO4。
5.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述piRNA序列为：GGC CCC AUG GUG UAA UGG UCA GCA CUC。
6.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述探针a序列为：GTG CTG ACC AT/rU/rA。
7.根据权利要求1所述的一
8.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述探针c序列为：Cy5-GGC CCC ATG GTG。
9.根据权利要求1所述的一种检测piRNA的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述探针d序列为：P-TAATGG TCAGCACTC-Biotin。
10.一种如权利要求1所述方法制备的量子点纳米传感器的应用，其特征是，所述量子点纳米传感器用于基于连接介导的指数放大单量子点纳米传感器的催化组装用于癌症组织中PIWI-相互作用RNA的灵敏检测法的应用，应用于灵敏地检测piRNA，最低检测限达到104aM；与基于DNA四面体探针的荧光方法相比，所提出的纳米传感器的灵敏度提高了6个数量级，与基于滚圈扩增的荧光分析相比，灵敏度提高了2个数量级。
...【技术特征摘要】
1.一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述t4 rna连接酶2缓冲溶液包括tris-hcl、mgcl2、dtt。
3.根据权利要求1所述的一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述ampligase缓冲溶液包括tris-hcl,kcl,mgcl2,nad,x-100。
4.根据权利要求1所述的一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述qd缓冲溶液包括tris-hcl,mgcl2,(nh4)2so4。
5.根据权利要求1所述的一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述pirna序列为：ggc ccc aug gug uaa ugg uca gca cuc。
6.根据权利要求1所述的一种检测pirna的量子点纳米传感器的制备方法，其特征是，所述探针a序列为：g...
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