【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞冻存，具体涉及到一种冻存肿瘤组织来源的类器官的培养方法。
技术介绍
1、在肿瘤类器官已经对癌症的研究产生了巨大的影响。肿瘤类器官的应用进一步加深了研究者对肿瘤的生物学和疾病的基本理解，逐渐打破以往临床和实验室研究的局限性，有望用于从疾病建模到药物筛选和个体化医疗。然而，肿瘤类器官培养面临的挑战不容忽视。肿瘤类器官的培养过程中因为操作步骤较多，容易出现失误，而且微生物的污染也是肿瘤类器官培养失败的重要原因，往往会造成整个样本的丢失。肿瘤组织来源于病人具有重要的科研和临床应用价值，是非常珍贵的研究材料，保证样本培养成功的技术值得探索。活肿瘤组织冻存即将组织置于低温环境中保存，以使组织暂时脱离生长状态，保存肿瘤组织的特性。如果肿瘤组织冷冻保存完好能够用于类器官的培养无疑是对类器官成功构建的保障。
2、目前的活肿瘤组织冻存方式一般为将组织减为小块后直接冻存。但是该冻存方法并不能够完好的保存组织的活性。冻存保护剂如dmso等需要快速进入组织才能够发挥更好的效果。使用现有方式冻存肿瘤组织时，肿瘤组织在冻存过程中会遭受冷冻损伤，渗透损伤等，最终导致肿瘤组织中的细胞活性下降，复苏后更无法进行增殖。该类冻存组织来源的肿瘤类器官培养成功率低，因此开发新的肿瘤组织保存方法及类器官构建及培养技术是提高冻存组织来源的类器官培养成功率的关键。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术公开了一种肿瘤组织冻存方法，以及该冻存样本来源的肿瘤类器官的培养方法。冻存方法可有效冻
2、本专利技术第一个方面公开一种冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，包括以下步骤，
3、a：将肿瘤组织块处理后，置于肿瘤样本冻存液中，并置于冻存管中进行冷冻保存；
4、b：将步骤a中经过冻存的肿瘤样本快速复苏，去除冻存液并用清洗液清洗样本，然后通过离心获得沉淀。
5、c：将步骤b中获得的沉淀和基质胶混匀后种板，并置于细胞培养箱中进行孵育。
6、d：待步骤c中的基质胶凝固，加入类器官培养基，置于细胞培养箱中进行培养，7-14天后可获得肿瘤类器官。
7、优选地，步骤a中处理的具体方法为：将肿瘤组织进行清洗，剪碎，然后用肿瘤组织消化液进行消化，离心获取沉淀，将沉淀重悬后进行100μm细胞筛网过滤，获得肿瘤单细胞和细胞团的沉淀。
8、优选地，所述组织消化液由advanced dmem/f-12,1mg/ml collagenses,20μg/mlhyaluronidase,10μmy-27632和2.5％fbs组成。
9、优选地，步骤a中的冻存方法具体为，将消化后获得的细胞沉淀与冻存液充分混合，置于冻存盒中于-80°短期冻存后，转移到液氮罐中进行长期保存。
10、优选地，所述冻存液具体由培养基、三甲基甘氨酸、二甲基亚砜、胎牛血清组成；
11、所述培养基为advanceddmem/f12；
12、所述三甲基甘氨酸的用量为20-100g/l；
13、所述二甲基亚砜的体积占冻存液体积的2-10％；
14、其中，所述胎牛血清体积占冻存液体积的50-90％。
15、优选地，所述三甲基-甘氨酸的用量为60g/l；
16、优选地，所述二甲基亚砜的体积占冻存液体积的5％；
17、优选地，所述胎牛血清含量占冻存液体积的90％。
18、优选地，所述新鲜肿瘤组织包括肠癌、胃癌和肺癌。
19、本专利技术的肿瘤组织冻存液中添加三甲基-甘氨酸作为细胞渗透压保护剂和冷冻损伤保护剂，以减少细胞在冻存过程中的损伤和满足长期冻存的需要；
20、本专利技术减少了二甲基亚砜的使用，降低了冻存液中有毒物质的浓度，减少对细胞活性影响。
21、本专利技术将冻存的肿瘤组织进行消化后冻存的方式，有效提高冻存保护剂快速进行细胞，降低了冻存过程中对肿瘤细胞活性的影响。
22、本专利技术将冻存的肿瘤组织进行消化后冻存的方式，通过减少复苏所需要的时间，减少与有毒物质接触时间，保证细胞活性。
23、本专利技术构建了冻存肿瘤组织来源的类器官培养方法，为新鲜肿瘤组织来源的类器官的构建提供了替代方法，有效提高肿瘤类器官的构建成功率。
24、与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
25、本专利技术开发了一种新的组织冻存液及使用方法，以及冻存的肿瘤组织来源的类器官的构建方法。本专利技术将冻存的肿瘤组织进行消化后冻存的方式，同时本专利技术对消化液和冻存液的组分和配比进行优化，利用本专利技术公开的方法，配合公开的消化液和冻存液配方，有效提高冻存保护剂快速进入细胞，降低了冻存过程中对肿瘤细胞活性的影响。
26、同时由于减少复苏所需要的时间，减少与有毒物质接触时间，保证细胞活性，有效提高肿瘤类器官的构建成功率。
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1.一种冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤，
2.如权利要求1所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，步骤A中处理的具体方法为：将肿瘤组织进行清洗，剪碎，然后用肿瘤组织消化液进行消化，离心获取沉淀，将沉淀重悬后进行100μm细胞筛网过滤，获得肿瘤单细胞和细胞团的沉淀。
3.如权利要求2所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，所述组织消化液由Advanced DMEM/F-12,1mg/mL collagenses,20μg/mL hyaluronidase,10μMY-27632和2.5％胎牛血清组成。
4.如权利要求1所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，步骤A中的冻存方法具体为，将消化后获得的细胞沉淀与冻存液充分混合后，放到冻存管中，再置于冻存盒中于-80°短期冻存后，转移到液氮罐中进行长期保存。
5.如权利要求4所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，所述冻存液具体由培养基、三甲基甘氨酸、二甲基亚砜和胎牛血清组成；
【技术特征摘要】
1.一种冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤，
2.如权利要求1所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，步骤a中处理的具体方法为：将肿瘤组织进行清洗，剪碎，然后用肿瘤组织消化液进行消化，离心获取沉淀，将沉淀重悬后进行100μm细胞筛网过滤，获得肿瘤单细胞和细胞团的沉淀。
3.如权利要求2所述的冻存肿瘤样本来源的类器官培养方法，其特征在于，所述组织消化液由advanced dmem/f-12,1mg/ml collag...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚敬，胡欣，陈璞，
申请(专利权)人：纳肽得青岛生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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