【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物工程，具体地说，涉及一种s.c-glna突变体及其重组微生物与应用。
技术介绍
1、谷氨酰胺是一种非必需氨基酸。化学名称为2-氨基-4-氨甲酰基丁酸。谷氨酰胺是蛋白质合成中的编码氨基酸，可促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，可用于治疗胃及十二指肠溃疡，在医药行业中有重要作用。
2、目前，谷氨酰胺最常用的生产方法为发酵法，主要以谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)为生产菌发酵生产谷氨酰胺。谷氨酸棒状杆菌是异养需氧型，为革兰氏阳性菌，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。谷氨酸棒杆菌自身的谷氨酰胺合酶(gs)会在glne的作用下发生腺苷酰化作用，导致谷氨酰胺合酶(gs)活性降低，前体谷氨酸积累较多，谷氨酰胺产量和转化率降低，因此异源引入不受glne调控的谷氨酰胺合酶，有利于促进谷氨酸转化为谷氨酰胺。文献(enhancing l-glutamine production incorynebacterium glutamicum byrational metabolic engineering combined with atwo-stage phcontrol strategy，qinglan lv等)报道在谷氨酸棒杆菌中引入酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)来源的glna，可以正常表达，scgs酶活显著高于cggs，且可以积累更多的谷氨酰胺。但仍有必要对其产量如何
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种新的l-谷氨酰胺产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
2、本专利技术提供了一种谷氨酸棒杆菌，将酿酒酵母来源的谷氨酰胺合酶编码基因进行密码子优化，然后通过易错pcr的方法构建突变体文库，筛选获得的质粒转化到谷氨酸棒杆菌mhz-0513-3中，通过摇瓶发酵比对谷氨酰胺产量，挑选出质粒pxmj19-s.c-glna6，测序结果表明，含有氨基酸序列突变位点c160w、l284p，同时将文献(enhancing l-glutamineproduction in corynebacterium glutamicum by rational metabolic engineeringcombined with a two-stage phcontrol strategy，2021，qinglan lv等)报道的酿酒酵母来源的glna构建表达质粒pxmj19-glnasc，酿酒酵母来源密码子优化未突变的glna构建表达质粒pxmj19-s.c-glna，出发菌内源的glna构建表达质粒pxmj19-glna，将这些表达质粒全都转化到谷氨酸棒杆菌mhz-0513-3中，比对发现酿酒酵母来源的谷氨酰胺合酶突变体更利于谷氨酰胺的生产，且单点验证，突变点c160w、l284p均有效，二者同时存在具有协同作用。
3、本专利技术的具体技术方案如下：
4、一种s.c-glna突变体，其以野生型s.c-glna的氨基酸序列为参考序列，所述s.c-glna突变体含有第160位半胱氨酸(c)被色氨酸(w)取代的突变，和/或，含有第284位亮氨酸(l)被脯氨酸(p)取代的突变。
5、本专利技术中，野生型s.c-glna为将酿酒酵母来源的谷氨酰胺合酶经密码子优化后表达的蛋白。
6、所述参考序列可为ncbi编号为scen_p03350的序列。
7、本专利技术经易错pcr获得突变菌株mhz-0513-3/pxmj19-s.c-glna6积累谷氨酰胺33.4g/l，产酸比对照菌株mhz-0513-3/pxmj19-s.c-glna提高8.4％，从中可知s.c-glna6中点突变c160w和l284p有利于谷氨酰胺的生产，且本专利技术通过单点验证c160w和l284p突变也有利于提高谷氨酰胺的产量。显而易见，含有c160w和l284p任何一个或者二者都包含的s.c-glna突变体利于谷氨酰胺及其衍生物的生产。
8、优选，所述s.c-glna突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
9、本专利技术还提供一种dna分子，其以seq id no.1为参考序列，所述dna分子含有第478-480位碱基由seq id no.1中的tgc突变为tgg的突变，和/或，含有第850-852位碱基由seq id no.1中的ctg突变为ccg的突变。
10、如seq id no.1所示的核苷酸序列是将酿酒酵母来源的谷氨酰胺合酶经密码子优化后的序列，其可更好地在谷氨酸棒杆菌中表达。
11、本专利技术另提供一种重组微生物，所述重组微生物表达上述s.c-glna突变体。
12、本专利技术中优选，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
13、本专利技术另提供一种上述重组微生物的如下任一种应用：
14、(1)在发酵生产l-谷氨酰胺及其衍生物中的应用；
15、(2)在用于生产l-谷氨酰胺及其衍生物的微生物遗传育种中的应用；
16、(3)在提高发酵生产l-谷氨酰胺及其衍生物产量上的应用。
17、本专利技术还提供一种l-谷氨酰胺的生产方法，其包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生物如上所述。
18、本专利技术的有益效果至少在于：
19、具有本专利技术突变体的发酵菌，其生产谷氨酰胺的能力得到了明显提升。本专利技术为发酵生产谷氨酰胺提供了一种新的方式。
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1.一种S.c-glnA突变体，其特征在于，以野生型S.c-glnA的氨基酸序列为参考序列，所述S.c-glnA突变体含有第160位半胱氨酸被色氨酸取代的突变，和/或，含有第284位亮氨酸被脯氨酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的S.c-glnA突变体，其特征在于，所述S.c-glnA突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种DNA分子，其特征在于，以SEQ ID NO.1为参考序列，所述DNA分子含有第478-480位碱基由SEQ ID NO.1中的TGC突变为TGG的突变，和/或，含有第850-852位碱基由SEQ IDNO.1中的CTG突变为CCG的突变。
4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物表达权利要求1或2所述的S.c-glnA突变体。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为谷氨酸棒杆菌。
6.权利要求4或5所述的重组微生物的如下任一种应用：
7.一种L-谷氨酰胺的生产方法，其特征在于，包括以重组微生物进行发酵培养的步骤，所述重组微生
...【技术特征摘要】
1.一种s.c-glna突变体，其特征在于，以野生型s.c-glna的氨基酸序列为参考序列，所述s.c-glna突变体含有第160位半胱氨酸被色氨酸取代的突变，和/或，含有第284位亮氨酸被脯氨酸取代的突变。
2.根据权利要求1所述的s.c-glna突变体，其特征在于，所述s.c-glna突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.一种dna分子，其特征在于，以seq id no.1为参考序列，所述dna分子含有第478-480位碱基由seq id no.1中的tgc突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：栾明月，姚嘉琪，吴涛，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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