【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物催化领域，具体地涉及南极假丝酵母脂肪酶b的分子进化及催化高效合成内酯类化合物。
技术介绍
1、内酯是一类重要的高价值化合物和中间体，在食品调味品工业、医药和制药领域有着广泛的应用。根据其羟基缩合位置的不同，脂肪族内酯分为不同类型，包括大环内酯类和α-、β-、γ-和δ-内酯。其中，小环δ-内酯因其浓郁的果香、独特的香气和稳定的理化性质，在食品和化妆品行业具有很高的商业价值。特别是具有奶油风味特征的δ-十二内酯，是最重要的δ-内酯之一，广泛用作食品中的化学调味剂。
2、δ-内酯可以通过多种方式生产，包括从植物中直接提取以及通过化学合成和生物合成。最常见的提取方法是从植物中提取；然而，由于它们的天然浓度低以及分离和纯化过程的复杂性，从植物中提取δ-内酯的成本很高。目前，有两种主要的δ-内酯生产化学合成工艺；第一种是δ-羟基酸酯化形成δ-内酯。第二种是更流行的化学路线，包括合成重要的中间体2-烷基环戊酮，然后通过baeyer-villiger获得δ-内酯氧化。这些过程需要有毒催化剂和不环保的试剂。作为合成δ-内酯的有效替代方法，生物合成已成为一种重要的环境友好和可持续的方法，它允许温和的反应条件和高选择性。最近，已经开发出一种酶系统，该酶系统使用waltomyceslipofer通过全细胞催化从相应的羟基酸合成δ-内酯。
3、作为一种多功能酶，calb可以催化涉及酯键形成和断裂的各种类型的反应，已被用于催化内酯的合成。robinson等人报道了使用来自南极洲的固定化脂肪酶从16-羟基
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供南极假丝酵母脂肪酶b的分子进化及催化高效合成内酯类化合物。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种体外环化缩合方法，包括步骤：
3、在南极假丝酵母脂肪酶b或其突变体的存在下，使得式(ⅰ)化合物发生环化缩合反应，从而形成式(ⅱ)化合物：
4、
5、其中，r1为h或甲基；
6、r2为h、na或k；
7、n＝2或3。
8、当n＝2时，产物为式(ⅱ)a化合物γ-癸内酯：
9、
10、在另一优选例中，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于seq id no:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶b序列。
11、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：e188q、e188d。
12、在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：i189f。
13、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：e188q/i189f、e188d/i189f。
14、当n＝3时，产物为式(ⅱ)b化合物δ-十二内酯：
15、
16、在另一优选例中，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于seq id no:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶b序列。
17、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：e188q、e188d、e188r。
18、在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：i189f、i189y、i189m。
19、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：e188q/i189f、e188d/i189y、e188d/i189f、e188d/i189m、e188r/i189f。
20、在另一优选例中，所述突变体催化5-羟基十二烷酸钠可直接生成相应的产物δ-十二内酯。
21、在另一优选例中，所述突变体催化4-羟基癸酸钠可直接生成相应的产物γ-癸内酯。
22、在另一优选例中，所述底物浓度为0.5-2mm底物。
23、在另一优选例中，所述反应体系为混合有机溶剂体系。
24、在另一优选例中，所述有机溶剂的种类无特别限制，对本反应底物及产物无影响即可。
25、在另一优选例中，所述混合反应体系中的有机溶剂的终浓度为80％-95％。
26、在另一优选例中，所述温度为37℃-52℃。
27、在另一优选例中，所述反应时间为11h-15h。
28、本专利技术的第二方面，提供一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶b突变体，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于seq idno:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶b序列。
29、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：e188q、e188d、e188r。
30、在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：i189f、i189y、i189m。
31、在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：e188q/i189f、e188d/i189f、e188q/i189f、e188d/i189y、e188d/i189f、e188d/i189m、e188r/i189f。
32、较佳地，所述的突变体为e188q/i189f。
33、在另一优选例中，所述的南极假丝酵母脂肪酶b突变体具有以下活性：催化5-羟基十二烷酸钠底物进行环化缩和反应，从而形成δ-十二内酯产物。
34、在另一优选例中，所述的南极假丝酵母脂肪酶b突变体具有以下活性：催化4-羟基癸酸钠底物进行环化缩和反应，从而形成γ-癸内酯产物。
35、本专利技术的第三方面，提供了一种编码野生型南极假丝酵母脂肪酶b的经密码子优化的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列如seq id no:2所示。
36、本专利技术的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第三方面所述的多核苷酸。
37、本专利技术的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第四方面所述的载体，或其基因组中整合本专利技术第三方面所述的多核苷酸。
38、在另一优选例中，合适的宿主细胞包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。
39、在本专利技术的第六方面，提供了一种本专利技术第二方面所述的南极假丝酵母脂肪酶b和突变体的用途，它被用于催化环化缩和反应，或被用于制备催化环化缩和反应的催化制剂。
40、本专利技术的第七方面，提供了一种南极假丝酵母脂肪酶b及其突变体体外催化合成内酯的方法，包括步骤：在本专利技术的第二方面所述的南极假丝酵母脂肪酶b及其突变体催化式(ⅰ)化合物进行环化缩和反应，从而形成内酯产物。
41、本专利技术的第八方面，提供了一种进行环化缩合反应的反应体系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种体外环化缩合方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝2时，产物为式(Ⅱa)化合物γ-癸内酯：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝3时，产物为式(Ⅱb)化合物δ-十二内酯：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；
5.一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有两个突变：E188Q、E188D、E188R、I189F、I189Y、I189M；其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体。
7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的
9.一种权利要求5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体的用途，其特征在于，它被用于催化环化缩和反应，或被用于制备催化环化缩和反应的催化制剂。
10.一种进行环化缩和反应的反应体系，其特征在于，所述的反应体系包括：
...【技术特征摘要】
1.一种体外环化缩合方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝2时，产物为式(ⅱa)化合物γ-癸内酯：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝3时，产物为式(ⅱb)化合物δ-十二内酯：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于seq id no:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶b序列；
5.一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶b突变体，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有两个突变：e188q、e188d、e188r、i189f、i189y、i189m；其...
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