【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表征目标多核苷酸的方法，尤其涉及一种psld突变体膜蛋白及其应用，属于基因工程和遗传工程领域。
技术介绍
1、纳米孔测序是一种新兴测序技术，具有实时、便携、潜在低成本、超长读长以及能检测核酸上表观遗传修饰信息等特点，作为第三代测序技术，展现出巨大的优越性，成为核酸测序技术的未来发展方向。目前纳米孔测序已被广泛应用于病原体的快速检测、食品安全监控、人类基因体测序、抗生素抗药性检测等领域。依据纳米孔的不同，纳米孔测序分为固态纳米孔测序和生物纳米孔测序。生物纳米孔测序采用天然孔道膜蛋白作为纳米孔，天然孔道膜蛋白具有特定的孔径结构、生物活性以及能够插入脂双分子层膜的能力，具有可进行灵活修饰的优势，近年来，生物纳米孔测序已取得很大进展。生物纳米孔是微型的小孔，其本质是在膜上形成通道，在外加电场的用下，离子通过纳米孔，产生恒定电流。带电核酸在电场力作用下通过生物纳米孔，造成电流的阻断。不同碱基对电流产生的阻碍作用不同，通过解析电流信号，可获得核酸链上的碱基序列信息。
2、与二代测序相比，目前纳米孔测序准确率偏低，纳米孔蛋白的性质是决定测序准确率的关键因素，因此，纳米孔蛋白的筛选与优化是研发纳米孔测序仪的过程中需要重点攻克的难关。组成核酸链的碱基的尺度为1nm的量级，只有孔径相当的纳米孔才能在核酸链过孔时实现有效的信号检测。此外，纳米孔蛋白孔道最窄处(收缩区)的厚度也是影响测序准确率的的关键因素，核酸链上相邻碱基之间的距离约为如果收缩区太厚，阻碍电流来自于多个碱基，信号解码的难度会显著增加，从而影响测序准确率。目
技术实现思路
1、本专利技术针对目前适用于纳米孔测序的孔道蛋白稀缺这一问题，发现了一种新型纳米孔蛋白psld并解析了其原子水平三维结构，丰富了纳米孔蛋白种类，为纳米孔测序提供了更多选择。psld蛋白是一种不同于mspa和csgg的独特的纳米孔蛋白，整体呈瓶状结构。瓶颈为匍匐的α螺旋及正向平行β桶组成的跨膜区，收缩区位于瓶底。野生型psld蛋白不能直接用于测序，收缩区截短改造后的突变体蛋白具有测序能力。本专利技术将通过进一步改造优化psld蛋白，提高第三代纳米孔测序准确率。
2、第一方面，本专利技术提供一种psld突变体纳米孔蛋白，所述psld突变体纳米孔蛋白是将seq id no:1所示的野生型psld的收缩区进行截短或截短替代。
3、在一些实施方案中，所述截短是从m65向c端截短1-10个氨基酸，优选2(m65-p66)、4(m65-l68)、6(m65-a70)或8(m65-n72)个氨基酸，或者从m65向c端用短的氨基酸序列进行替换，例如用3个氨基酸替换8个、9个、10个或11个氨基酸，优选地用gsg替换11个氨基酸(m65-t75)。
4、在一些实施方案中，所述psld突变体纳米孔蛋白的氨基酸序列如seq idno:2-6所示。
5、优选地，所述psld突变体纳米孔蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。
6、第二方面，本专利技术提供编码上述psld突变体纳米孔蛋白的核酸序列。
7、在一些实施方案中，所述核酸序列选自：
8、1)seq id no:8-12示；
9、2)与seq id no:8-12所示的核酸序列至少具有85％的同源性，且编码seq id no:2-6所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；
10、3)与1)或2)互补的核酸序列。
11、在一些实施方案中，同源性在85％-99％之间。
12、在一些实施方案中，同源性为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
13、第三方面，本专利技术提供包含上述核酸序列的重组载体。
14、第四方面，本专利技术提供一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有上述重组载体，或者其基因组中整合上述核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
15、第五方面，本专利技术提供包含上述纳米孔蛋白psld突变体的产品。
16、在一些实施方案中，所述产物是组合物、复合物、试剂盒。
17、第六方面，本专利技术提供上述纳米孔蛋白psld突变体的制备方法，包括以下步骤：
18、1)构建纳米孔蛋白psld突变体载体；
19、2)纳米孔蛋白psld突变体表达、纯化。
20、第七方面，本专利技术提供一种膜层，所述膜层中嵌入上述纳米孔蛋白psld突变体。
21、在一些实施方案中，所述膜层是磷脂膜层。
22、在一些实施方案中，所述膜层是磷脂单层膜层。
23、第八方面，本专利技术提供一种检测系统，包括上述纳米孔蛋白psld突变体或者上述膜层。
24、第九方面，本专利技术提供一种装置，包括上述纳米孔蛋白psld突变体、上述膜层或者上述检测系统。
25、第十方面，本专利技术提供上述纳米孔蛋白psld突变体、上述膜层或上述检测系统在制备样品测序和/或检测的装置中的应用。
26、在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
27、第十一方面，本专利技术提供上述纳米孔蛋白psld突变体、上述膜层、上述检测系统或上述装置在样品测序和/或检测中的应用。
28、在一些实施方案中，所述样品为核苷酸、核酸、氨基酸、寡聚肽、多肽、蛋白质中的一种或多种。
29、有益效果
30、本专利技术人发现了一种新型纳米孔蛋白psld并解析了其原子水平三维结构(附图3)。八聚体组装成的psld纳米孔呈瓶状结构，由r1、r2、r3三个结构域组成(附图4)。r1和r2位于周质空间内，r3为一种独特的跨膜区结构域，由八条匍匐的α螺旋和正向平行β桶组成。纳米孔总长为底部r1结构域宽β桶内径约(附图4)，底部收缩区现有氨基酸残基中第74位丙氨酸(ala)围成的孔道直径为(附图5)，是目前能看到的整个纳米孔道最窄处。
31、本专利技术人发现，野生型psld蛋白收缩区直径太小，阻塞孔道，因此不能嵌膜(附图7)。突变实验发现，将收缩区适当截短后的突变体蛋白能正常表达且性质稳定(附图6)。m65-n72删除的psld突变体可以很好的嵌膜，孔道电流大小在0.25na左右，自发封堵情况很少，电流性质相对稳定，具有对生物大分子如核酸底物测序的能力，后续可继续优化进一步降低电流噪音(附图8e)。
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1.一种PslD突变体纳米孔蛋白，所述PslD突变体纳米孔蛋白是将SEQ IDNO:1所示的野生型PslD蛋白的收缩区进行截短或截短替代；
2.编码权利要求1所述PslD突变体纳米孔蛋白的核酸序列；
3.包含权利要求2所述核酸序列的重组载体。
4.一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有权利要求3所述的重组载体，或者其基因组中整合权利要求2所述的核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
5.包含权利要求1所述PslD突变体纳米孔蛋白的组合物、复合物、试剂盒。
6.权利要求1所述PslD突变体纳米孔蛋白的制备方法，包括以下步骤：
7.一种膜层，所述膜层中嵌入权利要求1所述的PslD突变体纳米孔蛋白；
8.一种检测系统，包括权利要求1所述的PslD突变体纳米孔蛋白或者权利要求7所述的膜层。
9.一种装置，包括权利要求1所述的PslD突变体纳米孔蛋白、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统。
10.权利要求1所述的PslD突变体纳米孔蛋白、权利要求7所述的膜层
11.权利要求1所述的PslD突变体纳米孔蛋白、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述检测系统或权利要求9所述装置在样品测序和/或检测中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种psld突变体纳米孔蛋白，所述psld突变体纳米孔蛋白是将seq idno:1所示的野生型psld蛋白的收缩区进行截短或截短替代；
2.编码权利要求1所述psld突变体纳米孔蛋白的核酸序列；
3.包含权利要求2所述核酸序列的重组载体。
4.一种基因工程化的细胞或微生物，所述的细胞或微生物含有权利要求3所述的重组载体，或者其基因组中整合权利要求2所述的核酸序列；优选地，所述微生物为大肠杆菌。
5.包含权利要求1所述psld突变体纳米孔蛋白的组合物、复合物、试剂盒。
6.权利要求1所述psld突变体纳米孔蛋白的制备方法，包括以下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，
申请(专利权)人：北京普译生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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