【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的引物、试剂盒与方法。
技术介绍
1、蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌，兼性需氧。虽然自然界中大多数的蜡样芽孢杆菌均不具有致病性，但蜡样芽孢杆菌仍是我国食品中最新常见的污染菌和条件致病菌之一。肠毒素hbl是蜡样芽孢杆菌中常见的肠毒素之一，致病性蜡样芽孢杆菌该毒素的携带率在90％以上，因此开发一种快速准确的检测蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl的检测方法十分有必要。
2、目前检测蜡样芽孢杆菌的方法主要有三大类，分别为传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法。传统培养法费时费力，效率低，并且完全无法区分致病性蜡样芽孢杆菌和非致病性蜡样芽孢杆菌。免疫学检测方法和传统分子生物学方法虽然可以特异性地检测蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl，但都存在一定的局限性，前者的缺点是检测成本高且准确率较低，而后者检测时间较长，并且对设备要求较高。
3、交叉引物恒温扩增技术作为一种新型的核酸恒温扩增技术不仅摆脱了传统分子生物学检测方法对控温仪器的依赖，相较于其它恒温扩增技术都有着更高的灵敏度和准确度。因此建立一种针对蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl的具有独立知识产权的采用交叉引物恒温扩增技术的检测方法具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl的引物。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种采用交叉引物
3、本专利技术的又一目的在于提供一种采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl的方法。
4、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
5、一组采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的引物，由剥离引物4s和5a、交叉引物2a1s、特异引物2a和3a构成，其核苷酸序列如下：
6、剥离引物4s：5’-tcataacgcatacactt-3’(seq id no.1)；
7、剥离引物5a：5’-cactactgctactaccg-3’(seq id no.2)；
8、交叉引物2a1s：5’-tgaaagccaatcagcccacaggaacaaatgcgccaaatgc-3’(seq idno.3)；
9、特异引物2a：5’-tgaaagccaatcagcccaca-3’(seq id no.4)；
10、特异引物3a：5’-ccactccacatattatgaac-3’(seq id no.5)。
11、一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒，包括上述采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的引物。
12、所述的试剂盒中引物浓度均为10μm。
13、所述的试剂盒，还包括如下组分：
14、a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps；
15、b、bst dna聚合酶；
16、组分b中所述的bst dna聚合酶优选为浓度为8u/μl的bst dna聚合酶水溶液。
17、上述采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的引物或交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒在检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的应用。
18、一种根据上述试剂盒检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，包括如下步骤：
19、(1)提取待检样品的细菌dna作为模板，并确保模板dna水溶液的od260/od280值在1.8～2.0的范围内；
20、(2)建立检测蜡样芽孢杆菌hblb基因的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；
21、其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；
22、(3)待反应完成后于80℃水浴中加热2分钟终止反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳。如果电泳结果出现梯形条带，说明待检样品中含有蜡样芽孢杆菌hblb基因；如电泳结果无条带，说明待检样品中不含蜡样芽孢杆菌hblb基因。
23、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
24、(1)本专利技术中所提供的针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因hblb所设计的交叉引物恒温扩增方法，解决了现有技术方法检测时间长，灵敏度低，操作繁琐，成本高，现场应用困难等缺陷，弥补了快速检测领域致病性蜡样芽孢杆菌特异性检测的空白。
25、(2)本专利技术反应在等温条件下进行，不需要变温的过程，节省了大量的时间，在60分钟就可完成并获得检测结果，同其他恒温扩增技术相比在检测时间上也有着一定的优势，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测的应用具有重要的意义。此外，该方法不需要特殊、昂贵的仪器，检测成本较低。本专利技术的试剂盒及方法特别适用中小型食品企业的产品的自测及其他现场检测。同时，本专利技术还公开了针对蜡样芽孢杆菌肠毒素hbl的特异性靶序列保守区的特异区域并设计了一组检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。
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1.一组采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物，其特征在于由剥离引物4s和5a、交叉引物2a1s、特异引物2a和3a构成，其核苷酸序列如下：
2.一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
6.权利要求1所述的采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物或权利要求2～5任一所述的采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒在检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的应用。
7.一种根据权利要求2～5任一所述的试剂盒检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，其特征在于包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一组采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的引物，其特征在于由剥离引物4s和5a、交叉引物2a1s、特异引物2a和3a构成，其核苷酸序列如下：
2.一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，游珊迟，李雪杰，刘君彦，金河坡，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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