【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原制备，具体为一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用。
技术介绍
1、米酵菌酸(bongkrekic acid，ba)化学名为：3-羧甲基-17-甲氧基-6,18,21-三甲基-廿二碳-2,4,8,12,14,18,20-七烯二酸。米酵菌酸是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的毒素。食入该毒素污染的食物可引起人或动物中毒,重者可致死亡。米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品是引起中毒的主要原因。随着该类食品品种和制作的多样性，对米酵菌酸的检测能力和以及适应市场快节奏的快速检测能力的需求与日聚增。
2、现有技术中，检测米酵菌酸的主要分析方法是高效液相色谱(hplc)法和高效液相-质谱(hplc-ms)法。但这两种方法都存在耗时、前处理复杂、设备投入高的缺点，无法适应现在的市场需求。免疫分析法正好能有效的弥补仪器法的缺点，所以开发一种米酵菌酸免疫分析方法显得尤为重要。
3、一种可靠的免疫分析法的关键在于获取特异性强、灵敏度高的抗体。为达到此目的，合理的半抗原结构设计是关键。米酵菌酸化学结构中有三个羧基，三个羧基都可与蛋白中的氨基偶联，但这种偶联方式增大了蛋白结构的空间位阻干扰，影响免疫识别、抗原结构复杂、有效抗原收率低甚至蛋白交联。
4、基于上述目的，我们提出了一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，以解决上述背景技
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种米酵菌酸半抗原，在所述米酵菌酸的2位引入巯基，并通过连接臂与蛋白偶联得到米酵菌酸抗原，该米酵菌酸半抗原的结构如下所示：
3、
4、进一步优化本技术方案，所述米酵菌酸半抗原的合成包括以下具体步骤：
5、称取3mg的米酵菌酸加入到100mg的双2-二甲基氨乙基醚和双对甲苯磺酰基胺离子液体中，加热至60℃；
6、在液体中加入10mg硫化钠，保温反应18h；
7、将液体冷却至室温，加入3ml去离子水萃取，静置20min后取水相，重复萃取步骤三次合并水相；
8、合并的水相中加入30ml x 3乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸除乙酸乙酯得到米酵菌酸半抗原。
9、一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，基于上述的米酵菌酸半抗原进行抗原制备应用，所述的抗原制备应用包括以下具体流程：
10、s1、米酵菌酸半抗原的合成；
11、s2、米酵菌酸免疫原的制备；
12、s3、米酵菌酸包被原的制备；
13、s4、米酵菌酸单克隆抗体的制备；
14、s5、米酵菌酸免疫荧光检测卡的制备；
15、s6、食品中米酵菌酸检测；
16、s7、检测限实验；
17、s8、假阳性率、假阴性率实验。
18、进一步优化本技术方案，所述步骤s2中，米酵菌酸免疫原的制备包括以下具体操作流程：
19、称取8mg血蓝蛋白、2mg 4-n-马来酰亚胺甲基环几烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐加入1ml ph8.5的bb缓冲液中，室温活化4h，形成活化液；
20、将0.8mg的米酵菌酸半抗原溶于0.2ml dmf中，滴加入活化液中，室温反应8h；
21、分子量3kd的超滤管超滤除去未结合的低分子量物质得到米酵菌酸免疫原。
22、进一步优化本技术方案，所述步骤s3中，米酵菌酸包被原的制备包括以下具体操作流程：
23、称取8mg的牛血清白蛋白、2mg的4-n-马来酰亚胺甲基环几烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐加入1ml ph8.5的bb缓冲液中，室温活化4h，形成活化液；
24、将0.8mg的米酵菌酸半抗原溶于0.2ml dmf中，滴加入活化液中，室温反应8h；
25、分子量3kd的超滤管超滤除去未结合的低分子量物质得到米酵菌酸包被原。
26、进一步优化本技术方案，所述步骤s4中，米酵菌酸单克隆抗体的制备方法包括以下具体操作流程:
27、免疫：取米酵菌酸免疫原0.1mg注射6周龄balb/c小鼠腹腔，间隔三周免疫一次，总免疫三次，第三次免疫一周后采尾血测效价及抑制率；
28、细胞融合和克隆：取免疫的小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，间接elisa法筛选出阳性孔，阳性孔进一步间接竞争elisa鉴定筛选，有限稀释法克隆得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，得到的杂交瘤细胞株液氮冻存；
29、单克隆抗体制备：冻存细胞株复苏、培养、注入balb/c小鼠腹腔，7天后采集腹水，腹水纯化后即为米酵菌酸单克隆抗体，米酵菌酸单克隆抗体的抗体效价:64000,ic10:2ug/kg。
30、进一步优化本技术方案，所述步骤s5中，酵菌酸免疫荧光检测卡的制备包括以下具体流程：
31、s501、荧光微球活化；
32、s502、抗体标记；
33、s503、偶联物垫制备；
34、s504、样品垫制备；
35、s505、反应膜制备；
36、s506、组装。
37、进一步优化本技术方案，所述步骤s6中，食品中米酵菌酸检测包括以下具体流程：
38、样品前处理：称取量2g样品于20ml离心管中，加入10ml乙腈，涡旋2min，室温4000rpm离心5min，取上层有机相5ml在50℃水浴下氮气吹干，200ul0.01m pbs复溶；
39、检测：将待测定样品加到样品垫上，进行免疫反应将测定米酵菌酸的免疫荧光检测卡置于荧光读卡仪上，对荧光信号的强度进行读取；
40、结果的判断：当检测线和质控线在345nm激发光照射下同时显示橙色荧光，且检测线较质控线深或两者颜色相同或相近，即表示检测结果为阴性，当检测线和所述质控线在345nm激发光照射下，质控线显示橙色荧光，而检测线不显荧光或较质控线显色浅，即表示检测结果为阳性。
41、进一步优化本技术方案，所述步骤s7中，检测限实验包括以下实验内容：
42、取空白样品添加米酵菌酸至终浓度2ug/kg、4ug/kg、8ug/kg，按步骤s6的过程检测，重复三次。
43、进一步优化本技术方案，所述步骤s8中，假阳性率、假阴性率实验包括以下实验内容：
44、取空白样品添加米酵菌酸至终浓度4ug/kg按步骤s6的过程检测，重复三次；每种样本50份，三批次试纸条分别检测。
45、与现有技术相比，本专利技术提供了一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，具备以下有益效果：
46、该米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，在米酵菌酸的2位引入巯基通过连接臂与蛋白偶联得到半抗原，并完整保留米酵菌酸的结构特性，更好的暴本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，在所述米酵菌酸的2位引入巯基，并通过连接臂与蛋白偶联得到米酵菌酸抗原，该米酵菌酸半抗原的结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，所述米酵菌酸半抗原的合成包括以下具体步骤：
3.一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，基于权利要求1-2任一项所述的米酵菌酸半抗原进行抗原制备应用，其特征在于，所述的抗原制备应用包括以下具体流程：
4.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S2中，米酵菌酸免疫原的制备包括以下具体操作流程：
5.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S3中，米酵菌酸包被原的制备包括以下具体操作流程：
6.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S4中，米酵菌酸单克隆抗体的制备方法包括以下具体操作流程:
7.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S5中，酵菌酸免疫荧光检测卡的制备包括以下具体
8.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S6中，食品中米酵菌酸检测包括以下具体流程：
9.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S7中，检测限实验包括以下实验内容：
10.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤S8中，假阳性率、假阴性率实验包括以下实验内容：
...【技术特征摘要】
1.一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，在所述米酵菌酸的2位引入巯基，并通过连接臂与蛋白偶联得到米酵菌酸抗原，该米酵菌酸半抗原的结构如下所示：
2.根据权利要求1所述的一种米酵菌酸半抗原，其特征在于，所述米酵菌酸半抗原的合成包括以下具体步骤：
3.一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，基于权利要求1-2任一项所述的米酵菌酸半抗原进行抗原制备应用，其特征在于，所述的抗原制备应用包括以下具体流程：
4.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤s2中，米酵菌酸免疫原的制备包括以下具体操作流程：
5.根据权利要求3所述的一种米酵菌酸半抗原及其抗原制备应用，其特征在于，所述步骤s3中，米酵菌酸包被原的制备包括以下具体操作流程：
【专利技术属性】
技术研发人员：谭攀，陈晶，钟松清，刘小青，王燕萍，黄建飞，
申请(专利权)人：深圳市三方圆生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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