【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及测序。具体而言，本专利技术涉及一种测序失败或故障的补救方法。
技术介绍
1、根据中国国家基因库数字化技术平台的提供的统计数据，2021年上半年dnbseqtm测序平台总测序失败发生186起，失败率约4％(图1)，而illumina的nextseq500测序失败也有2-3％的水平。这些测序失败案例大部分是由于测序过程中发生一些突发状况导致，如：光学系统成像故障、测序反应异常、测序仪系统故障等等客观因素。
2、传统的测序故障挽救措施就是重新测序，即重新制备测序文库，并将该样品文库加载到新的测序芯片上，重新开始测序的全过程。这种挽救方法，需要消耗大量的人力和物力资源，同时也大大增加了测序的时间成本与测序费用，因此经济性差、且因为测序失败使芯片直接废弃，所以也带来了相应的环保问题。此外，对于稀少的测序样本来说，甚至没有足够的测序样本量支撑重新制备一张新的测序芯片，造成不可估量的损失。
技术实现思路
1、专利技术人已经发现作为现有测序故障挽救措施而进行的重新测序需要消耗大量的人力物力资源和时间，增加了测序的费用，并且环保性差。为此，专利技术人进行了深入研究，由此提出不需要重新测序而进行的挽救测序故障的新方法。
2、在一些实施方案中，本专利技术提供一种测序补救的方法，其包括下述步骤：1)获得包含测序模板链和测序链seq1的样品，2)去除所述步骤1获得的样品中的测序链seq1，和3)以所述测序模板链为模板进行测序步骤获得测序链seq2。
3、如阅
4、在一些实施方案中，本专利技术的测序补救方法的步骤2)包括去除测序链seq1。在一些实施方案中，去除测序链seq1的步骤可以通过本领域已知的任何适当方法进行，只要能够保持待测dna模板完整即可。在一些实施方案中，去除测序链seq1例如可以通过核酸酶进行。通过核酸酶消化dna序列的方法和体系是本领域技术人员熟知的，例如可以通过切口酶和/或核酸外切酶进行。切口酶可以在双链dna分子产生切口，然后可以通过例如dna聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性从切口的5′端除去测序链。核酸外切酶是指裂解连接寡核苷酸的末端核苷酸的磷酸二酯键的酶。在一些实施方案中，去除测序链seq1可以通过3′核酸外切酶和/或通过5′核酸外切酶进行，例如通过exo iii进行，例如通过lambda核酸外切酶进行。在一些实施方案中，可以使用5′端磷酸化的测序引物进行测序。在一些实施方案中，在使用5′端磷酸化的测序引物进行测序时，可以在测序补救中通过5′核酸外切酶例如lambda核酸外切酶去除测序链seq1。在一些实施方案中，去除测序链seq1可以通过3′核酸外切酶进行，例如通过exo iii进行。外切酶iii(exo iii)属于外切酶家族，具有3′至5′-端外切酶活性，不需要任何特异性识别位点。当底物凹陷或变钝时，exo iii通过逐步去除双链dna 3′-oh末端的单核苷，3′-末端在单链dna或带有突出的3′-末端的双dna上表现出较低的活性。专利技术人已经发现dna的测序结构与exo iii的水解底物具有极高的相似性，可以被exo iii识别水解恢复成单链的dna状态，可以重新杂交引物，从而进行新一轮的测序(图3)。在一些实施方案中，本专利技术可以利用exo iii的消化dna测序链，使dna链恢复成单链的状态，重新杂交引物后可以进行新一轮的测序，从而可以使测序失败芯片重新被测序。
5、在一些实施方案中，本专利技术的步骤3)可以添加新的链测序引物进行重新测序，例如以所述测序模板链为模板进行测序步骤重新获得测序链seq2，该seq2的读长完全包括seq1。如本领域技术人员已知的，测序读长可以在进行测序时通过设置测序仪的具体测试参数来控制。在一些实施方案中，例如，在使用coolmps测序方案时，在测序引物延伸中可以使用碱基上未标记荧光的cold dntps进行。在一些实施方案中，cold dntps可以仅有3′blocker可逆封端，荧光标记在特异性抗体上。在一些实施方案中，根据应用不同或者测序目的不同，可以设置不本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测序补救的方法，其包括下述步骤：
2.权利要求1所述的测序方法，其中去除测序链SEQ1通过核酸酶进行，例如通过切口酶和/或核酸外切酶进行。
3.权利要求1或2所述的方法，其中去除测序链SEQ1通过3′核酸外切酶和/或通过5′核酸外切酶进行，例如通过ExoIII进行，例如通过Lambda核酸外切酶进行。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中包括进一步依次循环操作步骤1)至步骤3)一次或多次，例如循环操作1、2、3次或更多次。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述测序链SEQ1为基于边合成边测序的方法的测序链，例如基于边合成边测序的第二代测序方法中的测序链，例如Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD、真迈基因单分子测序或BGI华大基因的DNB纳米球测序方法中的测序链。
6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述测序链SEQ1为Illumina Solexa测序方法的DNA cluster测序链或BGI华大基因的DNB纳米球测序方法中合成的测序链。
7.权利要求
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述方法用于稀有样品的测序补救。
9.权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述方法用于测序失败或测序故障的测序补救。
10.权利要求9所述的方法，其中所述测序失败或测序故障包括测序系统故障、光学系统成像故障、测序质量异常、测序反应异常和系统断电中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种测序补救的方法，其包括下述步骤：
2.权利要求1所述的测序方法，其中去除测序链seq1通过核酸酶进行，例如通过切口酶和/或核酸外切酶进行。
3.权利要求1或2所述的方法，其中去除测序链seq1通过3′核酸外切酶和/或通过5′核酸外切酶进行，例如通过exoiii进行，例如通过lambda核酸外切酶进行。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中包括进一步依次循环操作步骤1)至步骤3)一次或多次，例如循环操作1、2、3次或更多次。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述测序链seq1为基于边合成边测序的方法的测序链，例如基于边合成边测序的第二代测序方法中的测序链，例如roche 454、illumina solexa、abi solid、真迈基...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈莹，徐崇钧，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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