【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，具体涉及一种溶酶体靶向极性荧光探针的制备方法及其在生物成像方面的应用。
技术介绍
1、生物系统中微环境的变化对各种生物过程有着显著的影响，对相关状态的检测在疾病的诊断和分析、疾病病理机制的确定、新药物靶点的研究和开发具有重要意义。极性是一个重要的生物系统中一个微环境参数，会严重影响化学反应的速率和方向。极性对于建立和反映大量复杂的生理功能和病理作用至关重要，包括激活功能蛋白和免疫反应、触发信号转导和膜重排、蛋白结合的极性变化、刺激细胞迁移和细胞增殖，影响蛋白质的相互作用和酶的稳定性以及膜室的渗透性。已经证明极性的异常变化与如炎症、器官衰竭和癌症等多种疾病有关。因此，极性敏感染料能够可视化生物系统中的极性分布、变化和调节，可以促进对生物化学反应的研究，加深我们对重要生物过程的理解。此外，极性敏感染料也被用于区分关键的亚细胞微观结构。
2、溶酶体在包括蛋白质降解、分泌、质膜修复和自噬等细胞过程中起着重要作用。溶酶体的极性在细胞水平上影响酶和底物之间的相互作用活性，癌细胞中溶酶体极性的水平低于正常细胞，溶酶体自噬过程中极性会发生变化。因此，开发能够快速、灵敏地监测溶酶体极性变化的新方法，对于细胞生物学和相关病理研究具有重要意义[j.yin,l.huang,l.wu,j.li,t.d.james,w.lin,small molecule based fluorescent chemosensors forimaging the microenvironment within specific cell
技术实现思路
1、本专利技术目的在于一种溶酶体靶向极性荧光探针的制备方法及其在生物成像方面的应用。
2、本专利技术中的荧光探针，其分子结构如下：
3、
4、本专利技术中的荧光探针合成过程如下：
5、
6、a1：5-(4-(二苯基氨基)苯基)噻吩-2-甲醛；
7、b1：1-(4-(二甲基氨基)-2-羟基苯基)乙烷-1-酮；
8、phpt：(e)-1-(4-(二甲基氨基)-2-羟基苯基)-3-(5-(4-(联苯氨基)苯基)噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮。
9、所述探针phpt的制备步骤如下：
10、将4-溴三苯胺和5-醛基-2-噻吩硼酸置于圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃超声溶解。之后加入k2co3水溶液以及pd(pph3)4，混合溶液搅拌均匀，然后在氩气保护下加热回流18小时。将混合物冷却至室温后用二氯甲烷和水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂进行柱层析提纯(洗脱剂为v石油醚:v乙酸乙酯＝20:1)，得到黄色产物a1。
11、称取k2co3和4'-氨基-2'-羟基苯乙酮置于圆底烧瓶中，加入5ml无水乙醇超声溶解后再加入碘甲烷混合均匀。将混合溶液加热至55℃，回流36小时。反应结束后，冷却混合溶液至室温，并减压除去溶剂，加入硅胶进行柱层析提纯(v石油醚:v乙酸乙酯＝1:1)，真空干燥24小时后得到白色固体产物。
12、将化合物a1和b1置于圆底烧瓶中，加入甲醇超声溶解后，再加入60％naoh溶液，加热回流8小时。冷却混合溶液至室温后加冰水，用稀盐酸将溶液调至中性。有橙色沉淀析出，抽滤得到固体。进行柱层析提纯(洗脱剂为v石油醚:v乙酸乙酯＝20:1)，产物真空干燥后得到橙红色产物phpt。
13、本专利技术的荧光探针检测机制如下：
14、
15、在低极性条件下(水含量较低)，探针phpt由于与溶剂相互作用弱，分子在溶剂中处于分散状态，会发出弱而短的荧光。在高极性溶剂中(水含量较高)，由于与溶剂的相互作用，可能发生较大的电荷分离，激发态能量耗散，同时在不良溶剂中，分子发生聚集，从而产生强而长的荧光；在此过程中，产生了较大的stokes位移，可能适用于消除来自生物发光的潜在干扰。
16、图3是(a)探针phpt在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。(b)探针phpt在不同溶剂中的荧光发射光谱。(c)探针phpt在不同溶剂中的归一化荧光光谱(λex＝455nm，狭缝宽度：10nm，5nm，探针测试浓度为1×10-5mol/l)。在不同极性下，探针phpt的吸收光谱变化很小，表明基态探针的偶极矩随极性变化很小。选择455nm作为激发波长测试荧光发射光谱，发现随着极性的增加，探针phpt的发射波长显著红移，同时伴随着荧光强度增强。
17、图4展示了所制备探针phpt在不同溶剂中的光物理性质，包括最大吸光度λabs,max、最大发射λem,max、荧光量子产率φ。以上结果表明，从低极性的1,4-二氧六环到高极性的dmso，最大发射波长对应的荧光增强了近27倍。以0.1m naoh中的荧光素为参比(φ＝79％)，研究了探针phpt的光物理性质在不同溶剂中的差异，结果表明探针在dmso(二甲基亚砜)中的荧光量子产率(φ＝1.4％)远大于1,4-二氧六环中的量子产率(φ＝0.36％)，这些现象表明探针的偶极矩在激发态发生显著变化。
18、图5为(a)探针phpt在1,4-二氧六环中的粒径分布。(b)探针phpt在dmso中的粒径分布。探针在dmso中的粒径明显大于在1,4-二氧六环中的粒径。
19、图6(a)探针phpt在不同比例水和1,4-二氧六环中的紫外可见吸收光谱。(b)探针phpt在不同比例水和1,4-二氧六环中的荧光发射光谱。(c)探针phpt的发光色坐标图。(d)探针phpt的最大发射波长(λem,max)与溶剂极化率(δf)的关系(λex＝450nm，狭缝宽度：10nm，5nm，探针测试浓度为1×10-5mol/l)。随着水比例增加，探针phpt吸收光谱变化很小。随着混合溶剂中水含量从0％增加到30％(极性增加)，探针phpt的最大发射波长由569nm红移至643nm，并且最大发射波长对应的荧光信号增强。365nm手提紫外灯照射下，探针在纯1,4-二氧六环中发光呈橙色，在1,4-二氧六环与30％水的混合溶剂中发光呈浅红色，这与发光色坐标呈现的结果一致。在高极性环境中，最大发射波长的显著红移可能是由于探针phpt电荷分离程本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶酶体靶向极性荧光探针PHPT，其结构式为：
2.根据权利要求1的一种溶酶体靶向极性荧光探针PHPT的制备方法如下：
【技术特征摘要】
1.一种溶酶体靶向极性荧光探针phpt，其结构式为：
2...
【专利技术属性】
技术研发人员：于明明，马灵玲，徐勐，王蕙丽，李占先，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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