【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗，具体涉及禽腺病毒8a/8b嵌合疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、禽腺病毒(fowladenovirus，fadv)是属于禽腺病毒科(adenoviridae)禽腺病毒属的一种dna病毒。禽腺病毒可感染多种禽类，是家禽常见的传染病原之一且普遍存在，各日龄各品种的鸡均可感染发病。当前鸡群发病主要是鸡心包积液-肝炎综合征(hhs)、包涵体肝炎(ibh)，病死率高、病程长、危害大。根据病毒群特异性抗原的差异性，可将fadv分为ⅰ、ⅱ、ⅲ3个亚群。禽腺病毒ⅰ群分为a、b、c、d、e 5个基因型，按照hexon抗原中和能力，可分为12个血清型。当前国内主要流行c和e两种基因型，fadv-4、fadv-11、fadv-8a、fadv-8b等血清型均在国内感染鸡中分离到。
2、禽腺病毒颗粒无囊膜，核心衣壳二十面体，直径70～90nm。衣壳由五邻体、六邻体、纤突蛋白构成，其中纤突蛋白fiber突出于病毒粒子表面，在病毒感染、病毒与细胞相互作用和刺激机体产生中和抗体过程中发挥关键作用。腺病毒4型存在两个fiber蛋白：fiber1和fiber2。其中fiber2诱导产生针对腺病毒4的中和抗体。腺病毒8只存在一个fiber蛋白，并且它可以诱导产生针对病毒的中和抗体。但是由于fiber抗体有血清型特异性，这给禽腺病毒的交叉保护带来了挑战。特别是在面对包涵体肝炎这类由血清型d型的fiber2/11和e型的fadv-8a/8b禽腺病毒混合感染导致的疾病时，迫切需要能够提供多血清型抗体保护的疫苗。分子模拟的数据显示，在f
技术实现思路
1、本专利技术依据将尽可能多的抗原表位暴露在蛋白表面的原则，设计了嵌合体蛋白chifib-8b/8a，以期实现对禽腺病毒e型8a和8b的交叉保护。本专利技术将fadv-8b ml001的fiber蛋白中的1～443位氨基酸和fadv-8a jl/170408的fiber蛋白中的442～524氨基酸片段重组，产生新的嵌合体蛋白chifib-8b/8a。经试验验证该嵌合体蛋白chifib-8b/8a具有良好的抗原性。
2、本专利技术的目的之一是提供禽腺病毒e型嵌合体蛋白chifib-8b/8a，该嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3、本专利技术根据大肠杆菌密码子偏好设计了编码嵌合体蛋白chifib-8b/8a的基因，该基因的dna序列如seq id no:2所示。
4、本专利技术的目的之二是提供一种实现嵌合体蛋白chifib-8b/8a可溶性表达的载体。
5、本专利技术的目的之三是提供一种实现嵌合体蛋白chifib-8b/8a可溶性表达的重组菌，该重组菌中含有嵌合体蛋白chifib-8b/8a可溶性表达载体和分子伴侣蛋白质粒，能够实现嵌合体蛋白chifib-8b/8a的可溶性表达。
6、本专利技术的目的之四是提供一种培养上述重组菌的条件，该培养条件下，重组菌表达chifib-8b/8a蛋白的可溶性会显著提高，并且生产成本低，便于操作，适于大规模量产。
7、本专利技术的目的之五是提供一种纯化嵌合体蛋白chifib-8b/8a的方法，该方法能够有效提高chifib-8b/8a蛋白的产量和纯度，并且纯化周期短。
8、本专利技术的目的之六是提供嵌合体蛋白chifib-8b/8a在制备禽腺病毒fadv-8b/8a亚单位疫苗中的应用，该疫苗应激小，安全性高，并且能够有效地刺激体液和细胞免疫，抗禽腺病毒8a、8b强毒。
9、为达到上述专利技术目的，本专利技术采取的技术措施如下：
10、(1)chifib-8b/8a基因的人工修饰合成
11、参照禽腺病毒毒株ml001(genbankaccession numbers：mw284417)和jl/170408(genbankaccession numbers：mn417117)的fiber基因序列，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，人工合成完整的禽腺病毒chifib-8b/8a基因序列，其核苷酸序列为seq id no:2所示。
12、(2)重组载体的构建
13、人工合成禽腺病毒chifib-8b/8a基因后对其进行pcr扩增，插入pet32a载体，将连接产物转化dh5α感受态中，筛选氨苄青霉素抗性的单克隆，并对其进行pcr和酶切鉴定，获得重组pet32a-8b/8a载体。
14、(3)重组菌的构建
15、将pet32a-8b/8a载体转化入大肠杆菌bl21(de3)细胞中，筛选氨苄青霉素抗性的单克隆，并对其进行pcr鉴定，获得含有pet32a-8b/8a表达载体的重组菌；然后经典inoue方法将该重组菌制成感受态，并将分子伴侣质粒转入，获得最终表达可溶性chifib-8b/8a蛋白的重组菌。
16、(4)蛋白可溶性表达条件的确定
17、在37℃培养含有pet32a-8b/8a表达载体和分子伴侣的重组菌，在od值达到0.4～0.6后，在不同温度、不同iptg浓度、不同阿拉伯糖浓度的条件下培养细菌，检测chifib-8b/8a蛋白的可溶性表达水平，确定最适的诱导条件为16℃、0.5mm iptg、2g/l阿拉伯糖。
18、本专利技术的有益技术效果是：
19、本专利技术通过分子伴侣蛋白和目的蛋白chifib-8b/8a共表达，实现了chifib-8b/8a蛋白的可溶性表达，经过优化蛋白纯化方法，获得了高纯度的chifib-8b/8a蛋白，免疫实验动物后产生特异性免疫反应，能用于生产预防fadv-8b/8a的亚单位疫苗。
20、本专利技术根据大肠杆菌密码子的偏好性，设计禽腺病毒chifib-8b/8a的dna序列，该优化能够增大蛋白的表达。
21、本专利技术chifib-8b/8a蛋白表达载体选择的载体是pet32a，该载体有促进蛋白翻译的先导肽，能够促进蛋白的表达。本专利技术将分子伴侣蛋白和chifib-8b/8a蛋白同时表达，提高可溶性。
22、本专利技术所表达的chifib-8b/8a蛋白制备成亚单位疫苗，免疫动物后可产生特异性免疫反应。
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1.禽腺病毒E型嵌合体蛋白chiFib-8b/8a，其特征在于，所述嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述嵌合体蛋白的基因，其特征在于，所述基因的DNA序列如SEQ IDNO:2所示。
3.含有权利要求2所述基因的可溶性表达的载体。
4.含有权利要求3所述载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还含有分子伴侣蛋白质粒。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌诱导嵌合体蛋白可溶性表达的条件为：16℃、0.5mM IPTG、2g/L阿拉伯糖。
6.权利要求1所述的嵌合体蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的载体、权利要求4或5所述的重组菌在制备禽腺病毒8b/8a 亚单位疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，采用嵌合体蛋白制备亚单位疫苗，包括以下内容：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述油佐剂在使用前先行摇匀，量取所需重量或体积佐剂，高压蒸汽灭菌：121℃、30～40 分钟。
【技术特征摘要】
1.禽腺病毒e型嵌合体蛋白chifib-8b/8a，其特征在于，所述嵌合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.编码权利要求1所述嵌合体蛋白的基因，其特征在于，所述基因的dna序列如seq idno:2所示。
3.含有权利要求2所述基因的可溶性表达的载体。
4.含有权利要求3所述载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌中还含有分子伴侣蛋白质粒。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌诱导嵌合体蛋白可溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：王称心，宋鹏，姬星宇，周欣，丁丽萍，周晓琳，姚自萌，
申请(专利权)人：商丘美兰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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