【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞分离纯化，具体涉及不同纯度小细胞的纯化方法，即从小细胞形成体系中分离出小细胞细胞群体的方法。
技术介绍
1、大肠杆菌细胞正常分裂的结果是分裂为两个大小相等的子细胞，这是由细胞中间的z环负责调控的。小细胞(minicell)是纳米级的无染色体细胞，一般由杆状细菌母细胞体中的异常细胞分裂而形成。minicell包含除dna外的亲本细胞所有分子成分，包括膜、核糖体、rna、蛋白质以及质粒等。与正常细胞相比，minicell在无细胞核的环境中仍然保持细胞代谢功能，表现出优越的稳定性和特殊的耐受性。
2、为了提高minicell的应用范围，需要有效分离无核minicell与有核母体细胞，目前已提出多种纯化minicell的方法，主要包括差速离心法、多密度蔗糖梯度离心法以及多步过滤法等。然而，这些方法均存在一定的局限性，例如回收率低，成本增加等。虽然不同的纯化方法可以获得较纯的minicell，但要完全去除母体细胞仍具有一定的难度。
3、基于此，我们根据不同的研究需求开发了不同的纯化纯度的minicell方法。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中小细胞分离成本高，分离技术十分复杂的问题，提出的根据不同需求对应不同纯化纯度minicell的方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种小细胞的纯化方法，所述方法包括如下步骤：将大肠杆菌菌液通过差速离心法离心得到沉淀，将所述的沉淀经pbs缓冲
3、其中，所述的大肠杆菌，优选为bl21(de)3系列大肠杆菌。更优选为bl21(de)3△minc菌株，即以bl21(de)3为出发菌株，在其基因组上敲除minc基因即得，菌株详细信息见参考文献[rang,camilla u.；proenca,audrey；buetz,christen；shi,chao；chao,lin；bowman,grant r.(2018).minicells as a damage disposal mechanismin escherichiacoli.msphere,3(5)]。
4、其中，步骤(1)中，所述的大肠杆菌菌液按照如下方法制备得到，将大肠杆菌种子液以1％～2％v/v的接种量接种至降磷tb培养基中，28～37℃培养8～15h即得；所述的降磷tb培养基，其配方为：蛋白胨10～15g/l、酵母粉20～26g/l、十二水合磷酸氢二钠8～10g/l、磷酸二氢钾1～3g/l和甘油2～5ml/l。优选地，将大肠杆菌种子液以2％v/v的接种量接种至lb液体培养基或者降磷tb液体培养基中，37℃培养至od600为0.8左右时添加0.2mm iptg诱导剂，22℃、200rpm低温诱导蛋白表达24h。所述的降磷tb培养基，其配方为：蛋白胨12g/l、酵母粉24g/l、十二水合磷酸氢二钠9.4g/l、磷酸二氢钾2.2g/l和甘油4ml/l。
5、其中所述的大肠杆菌种子液，取-80℃甘油管保存的大肠杆菌以1‰v/v接种量接种至lb液体培养基中37℃、200rpm，过夜培养，即得。
6、其中，所述的差速离心法，将所述的大肠杆菌菌液先经低速离心，得到上清液，再将上清液高速离心，得到沉淀。所述的低速离心，离心力为400×g～1000×g，离心时间为1～10min；优选为800×g，5min；所述的高速离心，离心力为10000×g～13000×g，离心时间为10～20min；优选为13000×g，15min。。
7、其中，所述的混合纤维酯膜，其膜孔径为0.2μm～1.2μm。优选为0.2μm、0.45μm、0.8μm、1.0μm或1.2μm中的任意一种，更优选为0.8μm。所述的混合纤维酯膜购自于新亚牌、津腾、密理博、迈博瑞、盖德、普兰德中的任意一种，优选为密理博。
8、其中，所述的pbs清洗次数为0～5次；所述的混合纤维酯膜过滤次数为1～5次。优选地，所述的pbs缓冲液清洗次数为0～2次；所述的混合纤维酯膜过滤次数为1～2次。更优选地，所述的pbs缓冲液，ph为7.3～7.5。
9、其中，所述的沉淀，还可先添加抗生素培养后再经pbs清洗。所述的添加抗生素培养方法为：将所述的沉淀重悬在降磷tb液体培养基中，28～37℃活化20～60min；接着添加抗生素，28～37℃培养20～60min后进行所述的差速离心。优选地，将所述的沉淀重悬在降磷tb液体培养基中，37℃活化30min；接着添加抗生素，37℃培养40min后进行所述的差速离心。添加抗生素以破坏残留菌体细胞壁从而抑制菌体细胞继续生长。
10、其中，所述的抗生素，为氨苄青霉素、头孢曲松、阿奇霉素或诺氟沙星中的任意一种，优选为头孢曲松。
11、所述的抗生素，其添加浓度为30～200mg/l。优选为30mg/l、50mg/l、80mg/l、100mg/l、150mg/l或200mg/l；更优选为100mg/l。
12、其中，所述的降磷tb液体培养基的用量与大肠杆菌菌液的体积比为1:2～1:5，优选为1:4。
13、其中，可将所述的纯化方法进行简化，得到纯度较低的小细胞，简化后的具体方法为：将大肠杆菌菌液超声2min，然后在离心机中800×g、5min离心直接收集上清液，即得。
14、本专利技术提出的不同纯化纯度minicell的方法具有以下有益效果：
15、1、本专利技术旨在纯化过程中最大限度的提升高纯度minicell的得率，为了达到这一目标，专利技术人计算了细胞的得率和损失率，并尝试解决可能导致minicell产量降低的问题。
16、2、本专利技术根据实验的不同需求提出了不同纯度和得率小细胞的纯化方法，并通过逐步分析纯化过程中损失的原因，并采取相应措施来最大程度地提高minicell得率。根据对小细胞的纯度和/或得率的需求从而采取最合适的实验过程。本专利技术不仅能够实现高纯度的minicell纯化，小细胞纯度可达到88％，同时也能维持minicell大小在约600nm的情况下获得较高的minicell细胞数量，使同时提高小细胞纯度、得率和细胞大小成为可能。
17、3、本专利技术为了提高细胞生长量，采用了营养丰富的降磷tb培养基，在相同的培养条件下小细胞形成体系的细胞浓度(od600)从5增加到25，细胞生长量显著提高了约5倍。
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1.小细胞的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将大肠杆菌菌液通过差速离心法离心得到沉淀，将所述的沉淀经PBS缓冲液清洗后再经混合纤维酯膜过滤，即得纯化的小细胞。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的大肠杆菌菌液按照如下方法制备得到，将大肠杆菌种子液以1％～2％v/v的接种量接种至降磷TB培养基中，28～37℃培养8～15h即得；所述的降磷TB培养基，其配方为：蛋白胨10～15g/L、酵母粉20～26g/L、十二水合磷酸氢二钠8～10g/L、磷酸二氢钾1～3g/L和甘油2～5mL/L。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的差速离心法，将所述的大肠杆菌菌液先经低速离心，得到上清液，再将上清液高速离心，得到沉淀。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的低速离心，离心力为400×g～1000×g，离心时间为1～10min，优选为800×g，5min；所述的高速离心，离心力为10000×g～13000×g，离心时间为10～20min，优选为13000×g，15min。
5.根据权利要求1所述的纯化方
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液清洗次数为0～5次；所述的混合纤维酯膜过滤次数为1～5次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的沉淀先添加抗生素培养后再经PBS清洗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的添加抗生素培养方法为：将所述的沉淀重悬在降磷TB液体培养基中，28～37℃活化20～60min；接着添加抗生素，28～37℃培养20～60min后进行所述的差速离心。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述的抗生素，为氨苄青霉素、头孢曲松、阿奇霉素或诺氟沙星中的任意一种，优选为头孢曲松；
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的降磷TB液体培养基用量与所述的大肠杆菌菌液的体积比为1:2～1:5，优选为1:4。
...【技术特征摘要】
1.小细胞的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将大肠杆菌菌液通过差速离心法离心得到沉淀，将所述的沉淀经pbs缓冲液清洗后再经混合纤维酯膜过滤，即得纯化的小细胞。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的大肠杆菌菌液按照如下方法制备得到，将大肠杆菌种子液以1％～2％v/v的接种量接种至降磷tb培养基中，28～37℃培养8～15h即得；所述的降磷tb培养基，其配方为：蛋白胨10～15g/l、酵母粉20～26g/l、十二水合磷酸氢二钠8～10g/l、磷酸二氢钾1～3g/l和甘油2～5ml/l。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述的差速离心法，将所述的大肠杆菌菌液先经低速离心，得到上清液，再将上清液高速离心，得到沉淀。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的低速离心，离心力为400×g～1000×g，离心时间为1～10min，优选为800×g，5min；所述的高速离心，离心力为10000×g～13000×g，离心时间为10～20min，优...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳东，刘书利，应汉杰，张迪，王振宇，熊文韬，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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