【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物。具体地，本专利技术涉及抗egfr和cmet双特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
1、经过基因工程改造表达嵌合抗原受体(car)的t细胞已经被证明对某些b细胞白血病或者淋巴瘤亚型的患者具有治疗作用，并且对多发性骨髓瘤患者也显示了潜在的疗效。目前已有3个car t药物获批，分别为yescarta用于治疗大b细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤，tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤，以及kymriah用于治疗大b细胞淋巴瘤和针对小儿和年轻人的急性淋巴细胞白血病。car分子包括3个主要的结构成分，分别是细胞外抗原结合功能结构域；跨膜结构域，用以传递抗原识别信号；以及细胞内信号传导结构域。第一代的car仅包含cd3ζ激活信号，由于缺乏共刺激信号功能结构域，无法使car t细胞充分激活，显示出有限的细胞毒性，不能在体内有效扩增或持续存在。第二代car同时引入了cd28或4-1bb的共刺激功能结构域，增强了car t的细胞毒性，并提高了其持久性。目前car t细胞产品的上市药物均采用了二代的设计。通过添加另一个共刺激结构域，例如ox40、icos、cd27等，第三代car在二代的基础上进一步扩展，尽管报道其具有更强的持久性，但有可能会诱发细胞因子过量释放，目前在临床上的疗效并没有得到验证。为了扩展car t的疗效并将其应用到更广泛的恶性肿瘤，尤其是实体瘤，需要对car t进行创新性的工程化构建。
2、在car t细胞治疗过程中会出现多种不良反应，如细胞因子释放综合征(crs)，神经系统毒性，在靶/脱肿瘤的靶点毒性(on
3、因此本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体t细胞，既可同时识别多个抗原，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且能够降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体t细胞，既可同时识别多个抗原，又可增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤(on target/off tumor)毒性，提高细胞治疗的安全性。
2、本专利技术的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达第一car和第二car，所述第一car靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二car靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cmet、her2、her3、muc1、ror1、pd-l1、cd47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：egfr、epcam、her2、her3、或其组合。
3、在另一优选例中，所述免疫细胞含有第一car和第二car。
4、在另一优选例中，所述免疫细胞为nk细胞、巨噬细胞或t细胞，较佳地为t细胞。
5、在另一优选例中，所述第一car、第二car定位于所述免疫细胞的细胞膜。
6、在另一优选例中，所述第一car、第二car含有靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域。
7、在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。
8、在另一优选例中，所述抗原结合片段是fab或scfv或单结构域抗体sdfv。
9、在另一优选例中，所述第一car的结构如式i所示：
10、l1-s1-h1-tm1-c1-cd3ζ (i)
11、式中，所述“-”为连接肽或肽键；
12、l1为无或第一信号肽序列；
13、s1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cmet、her2、her3、muc1、ror1、pd-l1、cd47、或其组合；
14、h1为无或第一铰链区；
15、tm1为第一跨膜结构域；
16、c1为无或第一共刺激信号分子；
17、cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
18、在另一优选例中，所述靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域包括靶向肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列。
19、在另一优选例中，所述的靶向第一肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列的结构如式a1或a2所示：
20、vh1-vl1(a1)；或
21、vl1-vh1(a2)；
22、其中，vl1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；vh1为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。
23、在另一优选例中，所述的vl1和vh1通过柔性接头相连。
24、在另一优选例中，所述的柔性接头为1-5个(较佳地，2-4个)连续的ggggs所示的序列。
25、在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如seq id no.:1的第120-134位所示。
26、在另一优选例中，vl1的氨基酸序列如seq id no.:1中第135－247位所示，且vh1的氨基酸序列如seq id no.:1的第1－119位所示。
27、在另一优选例中，所述的靶向第一肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列如seqid no.:1所示。
28、在另一优选例中，所述第一car的氨基酸序列如seq id no.:2－4中任一所示。
29、在另一优选例中，所述第二car的结构如式ii所示：
30、l2-s2-h2-tm2-c2-z2 (ii)
31、式中，所述“-”为连接肽或肽键；
32、l2为无或第二信号肽序列；
33、s2为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：egfr、epcam、her2、her3、或其组合；
34、h2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD-L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第一CAR的结构如式I所示：
3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第二CAR的结构如式II所示：
4.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
6.一种如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。
7.一种用于选择性杀伤肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
8.一种
9.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求8所述的融合蛋白。
10.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求9所述的多核苷酸。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达第一car和第二car，所述第一car靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二car靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cmet、her2、her3、muc1、ror1、pd-l1、cd47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：egfr、epcam、her2、her3、或其组合。
2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第一car的结构如式i所示：
3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第二car的结构如式ii所示：
4.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学...
【专利技术属性】
技术研发人员：高明明，沈浩，靳利远，张伟伟，
申请(专利权)人：复星凯特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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