抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用，具体地，本发明专利技术提供了表达第一CAR和第二CAR的免疫细胞，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物。本发明专利技术的第一CAR和第二CAR同时识别相应肿瘤细胞标志物，免疫细胞可被充分激活，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。提高细胞治疗的安全性。

【技术实现步骤摘要】
抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
具体地，本专利技术涉及抗EGFR和cMet双特异性嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]经过基因工程改造表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞已经被证明对某些B细胞白血病或者淋巴瘤亚型的患者具有治疗作用，并且对多发性骨髓瘤患者也显示了潜在的疗效。目前已有3个CAR T药物获批，分别为Yescarta用于治疗大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤，Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤，以及Kymriah用于治疗大B细胞淋巴瘤和针对小儿和年轻人的急性淋巴细胞白血病。CAR分子包括3个主要的结构成分，分别是细胞外抗原结合功能结构域；跨膜结构域，用以传递抗原识别信号；以及细胞内信号传导结构域。第一代的CAR仅包含CD3ζ激活信号，由于缺乏共刺激信号功能结构域，无法使CAR T细胞充分激活，显示出有限的细胞毒性，不能在体内有效扩增或持续存在。第二代CAR同时引入了CD28或4
‑
1BB的共刺激功能结构域，增强了CAR T的细胞毒性，并提高了其持久性。目前CAR T细胞产品的上市药物均采用了二代的设计。通过添加另一个共刺激结构域，例如OX40、ICOS、CD27等，第三代CAR在二代的基础上进一步扩展，尽管报道其具有更强的持久性，但有可能会诱发细胞因子过量释放，目前在临床上的疗效并没有得到验证。为了扩展CAR T的疗效并将其应用到更广泛的恶性肿瘤，尤其是实体瘤，需要对CAR T进行创新性的工程化构建。
[0003]在CAR T细胞治疗过程中会出现多种不良反应，如细胞因子释放综合征(CRS)，神经系统毒性，在靶/脱肿瘤的靶点毒性(on
‑
target off
‑
tumor toxicity)以及肿瘤溶解综合征。其中CRS是系统性的，可累及全身各个器官，最频发以及症状最突出的急性不良反应，在临床上需要有效地对CRS进行管理和干预。由于肿瘤相关抗原在肿瘤细胞中高表达以外，也会在正常组织或细胞中有非特异性的低水平表达，例如CD19、Her2、ROR1、Muc1等。靶点毒性即CAR T细胞因识别正常组织表达的抗原而被激活，并造成对正常组织的损伤。CAR T治疗CD19阳性的恶性淋巴瘤，由于骨髓中具有表达CD19的B细胞祖细胞，其同肿瘤细胞一并被清楚，从而导致B细胞发育不良以及血红蛋白降低，临床上通过输注免疫球蛋白来代替B细胞产生的抗体功能。在一项以碳酸酐酶IX为靶点，治疗肾癌的CAR T细胞临床试验中，多名患者出现了肝酶异常，这些不良反应归因于CAR T细胞渗入并且作用于表达碳酸酐酶的胆管上皮。一名结直肠癌患者，在接受靶向Her2的CAR T细胞输注后，由于肺上皮细胞也表达低水平的Her2，患者则出现了致命的肺损伤。另外，在靶向EGFRvIII的CART治疗神经胶质瘤的临床试验中，也发生了类似的肺水肿毒性。由于单一靶向CAR T细胞有可能造成靶点毒性，并且目前很难通过IHC或者组织芯片等体外筛选的方法进行准确判断。
[0004]因此本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体T细胞，既可同时识别多个抗原，增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且能够降低在靶/脱肿瘤毒性，提高细胞治疗的安全性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体T细胞，既可同时识别多个抗原，又可增强靶向特异性，发挥抗肿瘤功效，并且降低在靶/脱肿瘤(ontarget/off tumor)毒性，提高细胞治疗的安全性。
[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD
‑
L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。
[0007]在另一优选例中，所述免疫细胞含有第一CAR和第二CAR。
[0008]在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞，较佳地为T细胞。
[0009]在另一优选例中，所述第一CAR、第二CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。
[0010]在另一优选例中，所述第一CAR、第二CAR含有靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域。
[0011]在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。
[0012]在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。
[0013]在另一优选例中，所述第一CAR的结构如式I所示：
[0014]L1
‑
S1
‑
H1
‑
TM1
‑
C1
‑
CD3ζ
ꢀꢀ
(I)
[0015]式中，所述
“‑”
为连接肽或肽键；
[0016]L1为无或第一信号肽序列；
[0017]S1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD
‑
L1、CD47、或其组合；
[0018]H1为无或第一铰链区；
[0019]TM1为第一跨膜结构域；
[0020]C1为无或第一共刺激信号分子；
[0021]CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
[0022]在另一优选例中，所述靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域包括靶向肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列。
[0023]在另一优选例中，所述的靶向第一肿瘤细胞标志物的抗体单链可变区序列的结构如式A1或A2所示：
[0024]V
H1
‑
V
L1 (A1)；或
[0025]V
L1
‑
V
H1
ꢀꢀ
(A2)；
[0026]其中，V
L1
为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的轻链可变区；V
H1
为抗第一肿瘤细胞标志物抗体的重链可变区；
“‑”
为连接肽(或柔性接头)或肽键。
[0027]在另一优选例中，所述的V
L1
和V
H1
通过柔性接头相连。
[0028]在另一优选例中，所述的柔性接头为1
‑
5个(较佳地，2
‑
4个)连续的GGGGS所示的序列。
[0029]在另一优选例中，所述柔性接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1的第120
‑
134位所示。
[0030]在另一优选例中，V
L1
的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第135－247位所示，且V
H1
的
氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一肿瘤细胞标志物，所述第二CAR靶向第二肿瘤细胞标志物，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD
‑
L1、CD47、或其组合；所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合。2.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第一CAR的结构如式I所示：L1
‑
S1
‑
H1
‑
TM1
‑
C1
‑
CD3ζ
ꢀꢀ
(I)式中，所述
“‑”
为连接肽或肽键；L1为无或第一信号肽序列；S1为靶向第一肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第一肿瘤细胞标志物选自下组：cMet、Her2、Her3、Muc1、ROR1、PD
‑
L1、CD47、或其组合；H1为无或第一铰链区；TM1为第一跨膜结构域；C1为无或第一共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。3.如权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述第二CAR的结构如式II所示：L2
‑
S2
‑
H2
‑
TM2
‑
C2
‑
Z2
ꢀꢀ
(II)式中，所述
“‑”
为连接肽或肽键；L2为无或第二信号肽序列；S2为靶向第二肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域，所述第二肿瘤细胞标志物选自下组：EGFR、EpCAM、Her2、Her3、或其组合；H2为无或第二铰链区；...

【专利技术属性】
技术研发人员：高明明，王立群，张伟伟，
申请(专利权)人：复星凯特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：