一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7-eGFP细胞株的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7

【技术实现步骤摘要】
一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学和细胞生物学
，具体涉及一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法。

技术介绍

[0002]全球范围内，肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，据WHO 2020年的估算，肝癌新增病例占所有肿瘤的第6位，死亡率高居第3位，而中国的新增死亡世界第一。其中，肝细胞癌(HCC)是常见的肝癌病理学类型，约占肝癌类患者的85％
‑
90％。目前为止，针对临床早期患者，肝癌的治疗手段有：手术治疗、射频消融，介入治疗等方式，但由于肝癌具有发病隐匿、复发率及转移率高等特点，患者的5年生存率仍然很低。此外，对于晚期患者，尽管系统化疗能减轻肿瘤负荷，然而因药物引发的副作用以及细胞耐药等原因，化疗效果也不尽如意。因此，对于肝细胞癌的发展及转移特性的了解，以及筛选选择性高、毒副作用小的抗癌药物，是治疗肝癌，改善患者预后的关键。
[0003]eGFP(增强型绿色荧光蛋白)是GFP的突变体，是一种优秀的报告基因，其荧光强、稳定，检测灵敏度高，操作简便，可用于细胞标记。为了获得稳定表达的细胞株，现有技术手段，常采用慢病毒转染的方式，然而，慢病毒转染会存在基因插入的风险。pCEP4是一种可以在人类细胞中进行非染色体复制的游离质粒载体，在灵长类细胞系中具有高水平的游离拷贝能力，一方面，该表达质粒不会插入到细胞基因组中，因此不会改变细胞特性，生物安全性高；另一方面，高水平的拷贝能力，允许该质粒可以在细胞内多次复制。此外，pCEP4质粒上携带潮霉素B筛选基因，因此，以利用潮霉素B进行阳性细胞的筛选。综上，将eGFP连接到pCEP4质粒载体上，构建出的pCEP4
‑
eGFP重组质粒，可以为筛选稳定荧光表达的肝癌细胞提供保障。
[0004]目前尚无商品化的表达荧光蛋白的肝癌稳定细胞株，在很大程度上限制了针对肝癌的靶向药物筛选和分子机制研究。因此筛选稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌细胞株对肝癌及相关领域的基础及临床转化研究具有重要的意义和广阔的应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的主要目的在于提供一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，旨在解决点胶质量和效率低、点胶不良率高的问题。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，包括如下步骤：
[0008](1)pCEP4
‑
eGFP重组质粒的构建
[0009]将绿色荧光蛋白eGFP连接至高拷贝质粒载体pCEP4上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCEP4
‑
eGFP质粒；
[0010](2)pCEP4
‑
eGFP质粒导入Huh7细胞
[0011]利用PEI转染试剂将pCEP4
‑
eGFP质粒转染进Huh7细胞中，然后将转染后的Huh7细胞扩大培养；再利用潮霉素B筛选Huh7细胞，将筛选得到的阳性Huh7细胞经有限稀释法后，获得阳性表达率高的Huh7细胞群；选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，并在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。
[0012]优选地，其中所述PEI转染试剂的体积与pCEP4
‑
eGFP质粒的质量比为3:1。
[0013]优选地，其中步骤(2)中，将转染后的Huh7细胞按照1:6倍数进行扩大培养。
[0014]优选地，其中利用潮霉素B筛选Huh7细胞的过程中，所述潮霉素B浓度为50
‑
300μg/ml。
[0015]优选地，其中利用所述潮霉素B筛选Huh7细胞的过程中，初始使用的潮霉素B浓度为300μg/ml；待对照组细胞全部死亡后，在单克隆形成之前，潮霉素B浓度为200μg/ml；待挑选单克隆后，潮霉素B浓度维持在50μg/ml。
[0016]优选地，其中所述PEI转染试剂通过如下方法配制：将50mg PEI加入到45ml ddH2O中，在56℃条件持续搅拌，加入3mlHCl，待PEI完全溶解后，冷却至室温，然后加入NaOH，将pH调节至6.9
‑
7.1，即得PEI转染试剂。
[0017]优选地，其中所述绿色荧光蛋白eGFP的基因序列如SEQ.ID.NO.1，所述质粒载体pCEP4的基因序列如SEQ.ID.NO.2。
[0018]优选地，其中在步骤(1)中，具体包括：
[0019]1a)用Q5 DNA聚合酶分别对eGEP及pCEP4片段进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；
[0020]1b)将纯化后的pCEP4、eGFP、连接酶以及缓冲液混合均匀后，置于37℃孵育30min，随后在冰上保持3min，得到pCEP4
‑
eGFP重组产物；
[0021]1c)将步骤2)所得的pCEP4
‑
eGFP重组产物转导至感受态大肠杆菌中，然后将所述大肠杆菌加入500μl SOC培养基中，在温度为37℃，转速为200rpm的条件下震荡孵育1h后，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经PCR验证后，将含有eGFP的菌体扩大培养和质粒提取，获得目的载体pCEP4
‑
eGFP质粒。
[0022]优选地，其中所述PCR扩增的过程中，所用的引物为SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4，SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.NO.6。
[0023]与现有技术相比，本专利技术至少具有以下优点：
[0024]1)本申请所提供的构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，以pCEP4作为骨架，该表达质粒不会插入到细胞基因组中，因此不会改变细胞特性，生物安全性高；且其具有高水平的拷贝能力，允许该质粒可以在细胞内多次复制，有利于获得稳定表达绿色荧光细胞的建立。
[0025]2)本专利技术的pCEP4质粒载体含有潮霉素B筛选基因，可用潮霉素B筛选稳定表达绿色荧光蛋白的细胞，且筛选周期短。
[0026]3)本专利技术所提供的方法简单，可操作性强，筛选出来的Huh7细胞稳定性强，为下游肝细胞癌的治疗及药物筛选提供了很好的工具。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述
中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0028]图1为本专利技术所述方法中的pCEP4
‑
eGFP质粒的结构图谱；
[0029]图2为本专利技术所述方法中pCEP4及eGFP基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)pCEP4
‑
eGFP重组质粒的构建将绿色荧光蛋白eGFP连接至高拷贝质粒载体pCEP4上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCEP4
‑
eGFP质粒；(2)pCEP4
‑
eGFP质粒导入Huh7细胞利用PEI转染试剂将pCEP4
‑
eGFP质粒转染进Huh7细胞中，然后将转染后的Huh7细胞扩大培养；再利用潮霉素B筛选Huh7细胞，将筛选得到的阳性Huh7细胞经有限稀释法后，获得阳性表达率高的Huh7细胞群；选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，并在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。2.根据权利要求1所述的构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，其特征在于，所述PEI转染试剂的体积与pCEP4
‑
eGFP质粒的质量比为3:1。3.根据权利要求2所述的构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，其特征在于，步骤(2)中，将转染后的Huh7细胞按照1:6倍数进行扩大培养。4.根据权利要求3所述的构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，其特征在于，利用潮霉素B筛选Huh7细胞的过程中，所述潮霉素B浓度为50
‑
300μg/ml。5.根据权利要求4所述的构建稳定表达绿色荧光蛋白的Huh7
‑
eGFP细胞株的方法，其特征在于，利用所述潮霉素B筛选Huh7细胞的过程中，初始使用的潮霉素B浓度为300μg/ml；待对照组细胞全部死亡后，在单克隆形成之前，潮霉素B浓度为200μg/ml；待挑选单克隆后，潮霉素B浓度维持在50μg/ml。...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱研，陈文婷，兰林，白家驷，毛青，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：