负载miR-206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法及应用技术

一种负载miR

【技术实现步骤摘要】
负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是目前备受关注的恶性消化道肿瘤之一，其死亡率逐年升高。近些年来，针对肿瘤治疗的外科手术技术和放化疗治疗方案有所进展，但由于放化疗对患者有着极大的副作用，故探索新型的治疗药物迫在眉睫。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，有必要提供一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法。
[0004]还有必要提供一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的应用。
[0005]一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法包括以下步骤：步骤S001，用包含目的基因miR
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206的慢病毒转染HT29结直肠癌细胞；步骤S002，使用嘌呤霉素筛选能够稳定过表达miR
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206的HT29结直肠癌细胞；步骤S003，收集HT29结直肠癌细胞的上清液，通过超速离心法获得负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体。
[0006]优选的，慢病毒转染HT29结直肠癌细胞包括以下步骤：步骤S101，将HT29结直肠癌细胞铺于六孔板中，等待HT29结直肠癌细胞贴壁生长；步骤S102，在六孔板中换用含有病毒LV
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miR
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206及LV
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NC和转染液HitransG P的细胞培养液，在CO2培养箱中37℃ 的温度下培养10小时；步骤S103，更换细胞培养液，继续培养48h，荧光显微镜下观察；步骤S104，当细胞培养液中的细胞量达到90%及以上时加入嘌呤霉素筛选出稳定株。
[0007]一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体在制备抗结直肠癌药物中的应用。
[0008]有益效果：本专利技术的负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体能够有效地结合结直肠癌细胞所表达的TIGIT分子，使TIGIT在结直肠癌细胞中的表达能力降低，从而影响结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力、有效的恢复免疫细胞的能力，从而有效地发挥其抗结直肠癌的作用。肿瘤细胞衍生外泌体miR
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206在基因水平上有效地发挥了抗结直肠癌能力。
附图说明
[0009]图1为转染前后HT29细胞中miR206的表达对比图。
[0010]图2为外泌体对细胞活力的影响对比图。
[0011]图3和图4为外泌体对结直肠癌细胞迁移能力的影响对比图。
[0012]图5和图6为外泌体对结直肠癌侵袭和趋化能力的影响对比图。
[0013]图7和图8为外泌体对结直肠癌细胞凋亡能力的影响对比图。
具体实施方式
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法包括以下步骤：步骤S001，用包含目的基因miR
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206的慢病毒转染HT29结直肠癌细胞；步骤S002，使用嘌呤霉素筛选能够稳定过表达miR
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206的HT29结直肠癌细胞；步骤S003，收集HT29结直肠癌细胞的上清液，通过超速离心法获得负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体。
[0016]进一步的，慢病毒转染HT29结直肠癌细胞包括以下步骤：步骤S101，将HT29结直肠癌细胞铺于六孔板中，等待HT29结直肠癌细胞贴壁生长；步骤S102，在六孔板中换用含有病毒LV
‑
miR
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206及LV
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NC和转染液HitransG P的细胞培养液，在CO2培养箱中37℃的温度下培养10小时；步骤S103，更换细胞培养液，继续培养48h，荧光显微镜下观察；步骤S104，当细胞培养液中的细胞量达到90%及以上时加入嘌呤霉素筛选出稳定株。
[0017]以下将通过qRT
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PCR检测结直肠癌细胞株HT29中的miR206的表达水平。检测过程如下：
①
引物设计miR206反转录引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACACmiR206FTGGAATGTAAGGAAGTmiR206RGTGCAGGGTCCGAGGTU6
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SCGCTTCGGCAGCACATATACU6
‑
RTTCACGAATTTGCGTGTCAT
②
提取miRNA：HT29细胞弃去培养液后，使用PBS洗涤，在培养瓶中加入2ml的LB10，充分吹打细胞使其全部脱落并收集于离心管中，继续吹打至无明显沉淀，静置5min；加入200μl的氯仿，剧烈震荡后，室温下孵育；10000g离心15min，转移水相于新离心管中；加入1/3转移水相体积的无水乙醇，颠倒混匀；将溶液加入RNA Spin Column中，12000g室温离心30s，保留流出液；准确测量流出液的体积，转移到RNase
‑
free离心管中，加入1.25倍体积的无水乙醇并混匀；将溶液加入miRNA Spin Column中，12000g室温离心30s，弃去流出液；加入500μl WB10，室温12000g离心30s，弃去流出液，重复一次；室温12000g离心2min，彻底去除残留乙醇；将miRNA Spin Column放入l.5 ml RNase
‑
free Tube中，加入30
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50 μl RNase
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free Water在离心柱的中央，室温静置1min；室温下12000g离心1min，洗脱miRNA；将miRNA置于
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80℃保存。
[0018]③
cDNA的合成：TotalRNA/mRNA50ng
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5μgAnchoredOligo（dT）Primer（0.5μg/μl）1μl
GPS2pmol2
✖
ESReactionMix10μlRT/RIEnzymeMix1μlgDNARemover1μlRNase
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freeWaterVaribleTotalvolume20μl
④
qRT
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PCR检测miR206水平：TemplateVariableForwardPrimer（10μM）0.4μlReversePrim本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤S001，用包含目的基因miR
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206的慢病毒转染HT29结直肠癌细胞；步骤S002，使用嘌呤霉素筛选能够稳定过表达miR
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206的HT29结直肠癌细胞；步骤S003，收集HT29结直肠癌细胞的上清液，通过超速离心法获得负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体。2.如权利要求1所述的负载miR
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206的肿瘤细胞衍生外泌体的制备方法，其特征在于：慢病毒转染HT29结直肠癌细...

【专利技术属性】
技术研发人员：段相国，苏春霞，田金花，刘淼，杨小娟，马斌，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：