一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CART的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可以靶向于FOLR1和NKG2D配体双靶点的嵌合抗原受体CAR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CAR T的制备及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种靶向NKG2D配体和FOLR1双打靶点CAR T的制备及应用。

技术介绍

[0002]在全球范围内，卵巢癌是女性第七大常见癌症，也是第八大致死癌症。尽管外科方法和化学疗法已有进步，5年生存率仍低于45％。更重要的是，每年确诊的病例数量也在增加，这对女性生命造成了严重威胁。
[0003]细胞免疫治疗是一种新型精准靶向疗法，具有显著疗效的肿瘤治疗模式，尤其是CAR
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T。CAR
‑
T细胞疗法首先从患者体内收集细胞，然后通过激活和基因工程对其进行修饰，使得T细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体是由胞外抗原结合区即识别肿瘤相关抗原的scFv、跨膜区和胞内信号域等组成。这些CAR
‑
T细胞被会回输到患者体内，它们可以识别和消灭表达指定抗原的肿瘤细胞。
[0004]叶酸受体1(Folate receptor1，FOLR1)又名叶酸受体α或叶酸结合蛋白，相较于肿瘤组织，其在正常组织上表达较低。它表达在细胞质膜上，可以介导细胞摄取叶酸并影响下游通路促进肿瘤生长。研究显示，FOLR1在大多数的卵巢癌(在恶性卵巢癌中的表达占76％)及子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌及乳腺癌中高表达，它可介导细胞摄取叶酸或产生调控信号来促进肿瘤细胞生长。FOLR1的这种表达模式使其成为适用于CAR
‑
T细胞治疗卵巢癌的一个良好的靶点。
[0005]NKG2D是一种重要的激活受体，表达于人类自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)、γδT细胞、CD8+T细胞以及一些自身反应性或免疫抑制的CD4+T细胞的表面。在人类细胞中，NKG2D配体(NKG2DLs)包括主要组织相容性复合体MHCI类相关链A和B(MICA和MICB)和6种独特的长16结合蛋白(UL
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BP1
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6)。这些分子在正常细胞中表达水平低或无法检测到，但在受压、恶性转化和感染细胞的表面迅速出现。并且，大多数人类肿瘤细胞都表达NKG2D配体，包括卵巢癌。因此，NKG2D配体也是一个治疗卵巢癌比较好的潜在靶点。
[0006]鉴于肿瘤的异质性,使用上述单一靶点并不能很好的实现对卵巢癌的治疗。另外，由于现行的基因修饰方法限制，很难实现回输的T细胞能够100％的被修饰。再加上一般T细胞很难浸润到实体瘤中，NKG2D配体则在肿瘤微环境中的各种类型的肿瘤细胞和免疫抑制细胞(例如Treg和髓样衍生的抑制细胞(MDSC))上表达，可以为打开肿瘤微环境提供帮助，因此这些配体为癌症治疗提供了有吸引力的靶标。
[0007]而若将上述的FOLR1与NKG2D两个靶点联用，目前同时实现对两种靶点杀伤的方法主要有双特异性CAR
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T。但是，其仍然存在一些缺陷，由于现行的基因修饰方法限制，很难实现回输的T细胞能够高效地被修饰，而且也不能调动患者体内的T细胞。
[0008]因此，本领域迫切需要开发出一种能够高效被修饰的、较大限度被调动回输的、更加广谱的双特异性的CAR
‑
T细胞。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的就是提供一种能够高效被修饰的、较大限度被调动回输的、更加广谱的双特异性的CAR
‑
T细胞。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR
‑
免疫细胞，所述CAR
‑
免疫细胞含有以下元件：
[0011](a)第一CAR，所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且所述的第一CAR的胞外结合域含有或不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
[0012](b1)任选的第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；
[0013](b2)任选的编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白；
[0014]其中，当所述的第一CAR的胞外结合域不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件时，所述的CAR
‑
免疫细胞含有(b1)和/或(b2)元件；
[0015]并且，所述的第一靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)，并且第二靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)；或者，所述的第一靶蛋白为所述的第一靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)，并且第二靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)。
[0016]在另一优选例中，所述的免疫细胞包括：T细胞、NK细胞或其组合。
[0017]在另一优选例中，所述的第一CAR的胞外结合域从N端到C端依次包括：任选的信号肽、靶向第一靶蛋白的第一结合原件、任选的连接序列，和靶向第二靶蛋白的第二结合原件；所述的第一CAR的胞外结合域从N端到C端依次包括：任选的信号肽、靶向第二靶蛋白的第二结合原件、任选的连接序列，和靶向第一靶蛋白的第一结合原件。
[0018]在另一优选例中，所述的连接序列是柔性肽段。
[0019]在另一优选例中，所述连接序列为(G4S)
n
，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)。
[0020]在另一优选例中，所述的CAR
‑
免疫细胞含有以下元件：
[0021](a)所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；和
[0022](b1)第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件。
[0023]在另一优选例中，所述的CAR
‑
免疫细胞含有以下元件：
[0024](a)所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；和
[0025](b2)编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白。
[0026]在另一优选例中，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：
[0027]L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
ꢀꢀꢀꢀ
(I)
[0028]式中，
[0029]各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；
[0030]L为任选的信号肽序列；
[0031]EB为胞外结合域；
[0032]H为任选的铰链区；
[0033]TM为跨膜结构域；
[0034]C为共刺激信号分子；
[0035]CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
[0036]在另一优选例中，式I中的“H
‑
TM
‑
C”的序列可以是CD28的胞外域、CD28的跨膜区和CD28的胞内结构域所组成的全长序列(即Extra_CD28本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体CAR
‑
免疫细胞，其特征在于，所述CAR
‑
免疫细胞含有以下元件：(a)第一CAR，所述的第一CAR的胞外结合域含有靶向第一靶蛋白的第一结合元件，并且所述的第一CAR的胞外结合域含有或不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；(b1)任选的第二CAR，所述的第二CAR的胞外结合域含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件；(b2)任选的编码BiTE的核酸序列，其中，所述的BiTE靶向第二靶蛋白；其中，当所述的第一CAR的胞外结合域不含有靶向第二靶蛋白的第二结合元件时，所述的CAR
‑
免疫细胞含有(b1)和/或(b2)元件；并且，所述的第一靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)，并且第二靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)；或者，所述的第一靶蛋白为所述的第一靶蛋白为杀伤细胞凝集素样受体(NKG2D)，并且第二靶蛋白为叶酸受体1(FOLR1)。2.如权利要求1所述的CAR
‑
免疫细胞，其特征在于，所述第一CAR或第二CAR的结构如下式I所示：L
‑
EB
‑
H
‑
TM
‑
C
‑
CD3ζ
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(I)式中，各
“‑”
独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；EB为胞外结合域；H为任选的铰...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡丰灿，龚剑，张宇，李秀云，周春燕，
申请(专利权)人：复星凯特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：