【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学工程，具体而言，涉及利用基因操作技术构建视网膜变性疾病模型的方法及应用。
技术介绍
1、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,rp)，是由视网膜光感受器和视网膜色素上皮变性所引起的遗传性眼病，是一种进行性、遗传性、营养不良性退行性病变。临床表现为夜盲、慢性进行性视野缺失、视网膜电图异常、视网膜上骨细胞样色素沉积和中周部视网膜进行性萎缩，最终可导致失明。发病原因通常是基因功能失常导致视杆视锥细胞功能异常，进而导致感光细胞凋亡。全球大约每5000人中就有1人受到影响，因此rp成为视网膜最常见的遗传性疾病，并且尚无有效的治疗方法，目前在研究过程中比较缺乏研究rp的疾病模型。
2、tmem41b是跨细胞膜或细胞器膜的蛋白质中的一种，tmem家族蛋白的表达在肿瘤组织中有显著的上调或下调，其中一些tmem蛋白被定义为肿瘤的潜在预后生物标志物，而tmem41b是一类进化保守的位于内质网上的跨膜蛋白，磷脂双层膜是生命的根本特征，在微观层面界定了“非我”和“自我”；磷脂双层膜生成的关键步骤是磷脂的高效跨膜翻转，这种跨膜转运的成功进行就是需要内质网翻转酶，促进脂质的快速周转，内质网跨膜蛋白tmem41b最近被鉴定为一种脂质翻转酶，其介导跨双层磷脂运动，并在维持脂蛋白生物发生和脂质代谢中起重要作用。
3、自2018年以来，已经有三次独立的全基因组筛选发现tmem41b是自噬小体形成的关键因素。有研究表明在涉及自噬的超敏原细胞中，有定位于自噬囊泡的tg9和定位于内质网膜的tmem41b(跨膜
4、有研究鉴定出tmem41b在儿童神经退行性疾病脊髓性肌萎缩(sma)的动物模型中是一个重要影响基因，所以最初tmem41b被认为在哺乳动物正常神经传递以及发育中起着重要的作用。
5、最近，tmem41b和vmp1也被发现是细胞脂质稳态的重要调节因子，涉及肝脏tmem41b消融的体内小鼠模型表明，这些蛋白的敲除可导致非酒精性脂肪性肝炎(nash)和系统性血脂异常的快速发展。
6、为了更好地筛查和研究视网膜色素变性疾病，以及筛选出有效的靶向治疗药物，本领域需要鉴定出更多新的视网膜色素变性疾病致病基因，需要更多的模拟出视网膜色素变性疾病特征的动物模型。
7、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用基因操作技术构建视网膜变性疾病模型的方法及应用以解决上述技术问题。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其包括如下任意一种的方法：
4、(1)敲除非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的tmem41b基因；
5、(2)通过基因沉默技术使得非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的tmem41b基因的表达量下降。
6、专利技术人发现通过敲除非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的tmem41b基因，或者通过基因沉默的方法使得非人目标动物的视网膜视杆细胞基因组中的tmem41b基因不表达，可以获得表现有视网膜色素变性疾病(rp)的动物模型。因此，视网膜视杆细胞中的tmem41b基因被敲除或被沉默的动物可以作为rp疾病模型，用于rp疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的模型。
7、在本专利技术应用较佳的实施方式中，敲除tmem41b基因是指敲除tmem41b基因的外显子序列或全长序列。本领域的技术人员可以根据需要选择敲除tmem41b基因的全长序列或部分序列例如部分外显子。无论敲除那种类型(部分或全长)的序列，只要是能够在视杆细胞中沉默tmem41b基因的表达，使动物表现出rp疾病相应特征即属于本专利技术的保护范围。
8、在本专利技术应用较佳的实施方式中，敲除tmem41b基因是指敲除tmem41b基因的第1号到第7号外显子中的至少一个外显子序列。本领域的技术人员可以根据需要选择敲除tmem41b基因的第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子中的任意一种。也可选择敲除tmem41b基因的第1号外显子和第2号外显子；或敲除第3号外显子和第4号外显子；或敲除第3号外显子、第4号外显子和第5号外显子；或敲除第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；或敲除第1号至第7号外显子。
9、在一种可选的实施方式中，敲除tmem41b基因是指敲除tmem41b基因的第3号到第5号外显子序列。选择第3号至第5号外显子进行敲除具有良好的敲除效率。
10、tmem41b基因(ncbi参考序列:nm_153525；ensembl:ensmusg00000047554)位于小鼠7号染色体,共鉴定出7个外显子，其中atg起始密码子位于外显子1,tga终止密码子位于外显子7(transcript:ensmust00000094097)。
11、在本专利技术应用较佳的实施方式中，敲除采用的是选自crispr/cas9技术、crispr/cas12a技术、crispr/cas13a技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶技术和cre-loxp基因敲除技术中的至少一种。但在其他的实施例中，在明确了所敲除基因的前提下，采用本领域常规的基因编辑技术是容易实现基因敲除目的的。
12、在一种可选的实施方式中，敲除采用的是选自crispr/cas9技术和cre-loxp基因敲除技术。
13、在本专利技术应用较佳的实施方式中，将含非人目标动物tmem41b基因的grna载体或向导rna复合物、cas9 mrna或cas9蛋白通过转化或化学转染至非人目标动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标动物的子宫中，获得tmem41b基因条件性敲除的首建动物。转化包括不限于电转化。
14、在一种可选的实施方式中，将首建动物进行交配，筛选tmem41b基因条件性敲除纯合子动物；再将tmem41b基因条件性敲除纯合子动物与带有cre基因的动物交配获得tmem41b基因敲除的动物。
15、在一种可选的实施方式中，grna载体或向导rna复合物包括loxp位点；
16、在一种可选的实施方式中，cas9蛋白为cas9蛋白或经修饰的cas9蛋白。经修饰的cas9蛋白包括不限于在cas 9蛋白的c端加上eve等抑制活性的功能结构域，可以特异性地抑制目的基因的表达。
17、在本专利技术应用较佳的实施方式中，基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下任意一种的方法：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除Tmem41b基因是指敲除Tmem41b基因的外显子序列或全长序列。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，敲除Tmem41b基因是指敲除Tmem41b基因的第1号到第7号外显子中的至少一个外显子序列；
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述敲除采用的是选自CRISPR/Cas9技术、CRISPR/Cas12a技术、CRISPR/Cas13a技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶技术和Cre-loxp基因敲除技术中的至少一种；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将含非人目标动物Tmem41b基因的gRNA载体或向导RNA复合物、Cas9 mRNA或Cas9蛋白通过转化或化学转染至非人目标动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标动物的子宫中，获得Tmem41b基因条件性敲除的首建动物；
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，采用CRISPR/dCas9技术进行基因沉默的方法如下：将含非人目标动物Tmem41b基因的gRNA载体或向导RNA复合物、dCas9 mRNA或dCas9蛋白通过转化或化学转染至非人目标动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标动物的子宫中，获得Tmem41b基因表达量下降的动物；所述dCas9 mRNA的3’端连接有阻遏复合物的mRNA序列或dCas9蛋白的C端连接有阻遏复合物；
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述非人目标动物选自非人目标哺乳动物；
9.如权利要求1-8任一项所述的构建方法构建获得的视网膜色素变性疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜变性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述药物具有如下至少一种的用途：
10.如权利要求1-8任一项所述的视网膜变性疾病模型的构建方法构建的视网膜变性疾病模型在视网膜变性疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
...【技术特征摘要】
1.一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法，其特征在于，其包括如下任意一种的方法：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，敲除tmem41b基因是指敲除tmem41b基因的外显子序列或全长序列。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，敲除tmem41b基因是指敲除tmem41b基因的第1号到第7号外显子中的至少一个外显子序列；
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述敲除采用的是选自crispr/cas9技术、crispr/cas12a技术、crispr/cas13a技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术、转录激活因子样效应物核酸酶技术和cre-loxp基因敲除技术中的至少一种；
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，将含非人目标动物tmem41b基因的grna载体或向导rna复合物、cas9 mrna或cas9蛋白通过转化或化学转染至非人目标动物的受精卵中，取胚胎细胞移植到假孕非人目标动物的子宫中，获得tmem41b基因条件性敲除的首建动物；
6.根据权利要求1所述的构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱献军，雷博，刘璐，向乾春，姚舜，
申请(专利权)人：河南省立眼科医院，
类型：发明
国别省市：
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