【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种mrec突变体及其在l-缬氨酸发酵生产中的应用，特别涉及一种mrec突变体及其核酸分子在构建l-缬氨酸工程菌和l-缬氨酸发酵生产中的应用。
技术介绍
1、l-缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，也是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸之一。l-缬氨酸在饲料、食品和医药、化妆品、抗生素和除草剂等领域有着重要的应用。尤其是在饲料领域，2018年，中国饲料工业协会起草的t/cfias 001-2018《仔猪、生长育肥猪配合饲料》团体标准中专门增设了l-缬氨酸的最低限量；2017-2019年期间l-缬氨酸呈现年均复合增长率接近100％的增长趋势；因此未来l-缬氨酸在饲料领域的应用和需求量必将越来越大，市场潜力无限。l-缬氨酸还可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等，因此在食品和医药领域也具有广泛的应用。随着l-缬氨酸由传统饲料添加剂向食品、医药、化妆品等高附加值行业的迅猛发展，在国家政策的引导下，l- 缬氨酸的市场需求量势必会引来突破性增长，l-缬氨酸将成为猪禽日粮中下一个限制性氨基酸。据中国生物发酵产业协会数据显示，2019年全球缬氨酸需求量约3.25万吨，未来增长率达24％，市场潜力巨大。
2、随着合成生物学和代谢工程的快速发展，以可再生资源为原料，通过微生物发酵实现绿色、环保、高效生产大宗化学品、精细化工品和天然产物等化合物的技术越来越受到重视，并逐渐成为替代石油基化学品的重要力量，呈蓬勃发展之势。目前，l-缬氨酸主要通过发酵法生产获得。目前l-缬氨酸发酵生产多是通过好氧或者两步法发酵
3、针对上述技术弊端，现有技术中有针对缬氨酸厌氧发酵过程进行菌株改造，包括对代谢通路中相关酶基因的导入、敲除等以解决辅因子不平衡问题，进而实现厌氧条件下重组菌株高效生产l-缬氨酸，但上述改造的重组菌株在未经驯化的情况下，其发酵生产 l-缬氨酸能力仍有待提高。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种mrec突变体及其在l-缬氨酸发酵生产中的应用。本专利技术通过在微生物基因组引入可显著改善工程菌株生长和缬氨酸产量的基因组突变，可以显著提高缬氨酸工程菌株的生产能力和生物量。
2、第一方面，本专利技术提供了一种mrec突变体，其为由seq id no.:3所示氨基酸序列组成的蛋白质。
3、进一步地，所述mrec突变体为seq id no.:2所示的ecolc_0457杆状决定蛋白氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质。
4、第二方面，本专利技术提供了编码上述mrec突变体的核酸分子。
5、进一步地，所述核酸分子为(a1)-(a2)中任一种所述的dna分子：
6、(a1)编码区是seq id no.:4所示的dna分子；
7、(a2)核苷酸序列是seq id no.:4所示的dna分子。
8、其中，seq id no.:4所示dna分子为seq.idno.:1所示野生型mrec基因的编码区核苷酸序列的第450位引入点突变，将c突变为t。
9、第三方面，本专利技术提供了一种生物材料，其为下述(b1)-(b3)中任一种：
10、(b1)含有上述核酸分子的基因表达盒；
11、(b2)含有上述核酸分子的重组载体；
12、(b3)含有上述核酸分子的重组微生物。
13、进一步地，所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
14、进一步地，所述重组微生物可为含有上述重组载体的微生物；所述微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。更进一步地，所述细菌可为大肠杆菌。
15、本专利技术还提供了下述(c1)-(c2)中任一种应用：
16、(c1)上述mrec突变体或核酸分子或生物材料在构建l-缬氨酸工程菌的应用；
17、(c2)上述mrec突变体或核酸分子或生物材料在l-缬氨酸生产中的应用。
18、本专利技术还提供了一种l-缬氨酸工程菌的构建方法，包括下述步骤：向微生物中导入上述核酸分子。
19、其中，微生物为现有技术中任何具有生产l-缬氨酸性能且产l-缬氨酸途径中涉及杆状决定蛋白mrec的微生物；大肠杆菌因遗传背景清晰、基因操作工具方便、底物利用广泛、易培养，并且生长快速等优点，已经成为代谢工程改造中最主要的模式菌株之一，并实现了利用工程菌株生产l-丙氨酸、d-乳酸和丁二酸等化合物的产业化，故优选为大肠杆菌，所述大肠杆菌可以是野生型的，也可以是不影响生产l-缬氨酸目的的任何突变类型的；大肠杆菌mg1655被认为是生物安全的微生物菌株，故更优选为大肠杆菌 mg1655。
20、在厌氧发酵时，葡萄糖的代谢主要是通过糖酵解途径，1mol葡萄糖代谢生产2mol丙酮酸的同时，会生成2molatp和2molnadh，导致厌氧条件下改造的大肠杆菌中出现氧化还原力供给不平衡的问题，即nadh过剩，而nadph供给不足。
21、为解决厌氧发酵时还原力平衡问题，以实现在厌氧条件下高效生产l-缬氨酸，本专利技术还对上述重组微生物进行下述(d1)-(d2)任一种改造：
22、(d1)向上述重组微生物中导入nadh依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因kari和nadh依赖型亮氨酸脱氢酶基因leudh，使得酶活性增强；
23、(d2)向上述重组微生物中导入nadph依赖型乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvc、和导入nadh依赖型亮氨酸脱氢酶基因leudh、和激活转氢酶pntab的活性、和激活nad 激酶yfjb的活性，使得酶活性增强。
24、所述“导入”可以以本领域已知的任何合适方式，例如以质粒形式，或者整合入基因组中的形式存在于所述微生物中。
25、在一个实施方式中，所述整合入基因组中的酶编码基因置于合适的调控元件控制下整合入微生物的基因组中。
26、在一个实施方式中，将包含酶编码基因和调控元件序列的质粒导入所述微生物中。
27、所述“激活”可以通过本领域已知的任何方式，例如将待激活的酶编码基因置于合适的调控元件控制下，以使得所述酶基因的表达增强。
28、调控元件可通过已知的基因工程方法插入目标基因的上游。所述方法包括但不限于以基因重组的方式，例如以同源重组的方式调控元件的序列插入目标基因编码序列上游，以增强目标基因表达的强度。
29、所述调控元件可选自m1-93人工调控元件、m1-37人工调控元件、m1-46人工调控元件或rbs5人工调控元件。
30、在一个实施例中，m1-93人工调控元件调控乙酰乳酸合成酶基因ilvbn、乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种mreC突变体，其为由SEQ ID No.:3所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的mreC突变体，其特征在于，所述mreC突变体为SEQ ID No.:2所示的杆状决定蛋白氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质。
3.编码权利要求1所述mreC突变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为(a1)或(a2)所述的DNA分子：
5.一种生物材料，其为下述(b1)-(b3)中任一种：
6.下述(c1)-(c2)中的任一种应用：
7.一种L-缬氨酸工程菌的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：向微生物中导入权利要求3或4所述核酸分子。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：还包括进行下述(d1)或(d2)的改造：
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：还包括对重组微生物进行以下(1)-(6)中的改造：
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述微生物为大肠杆菌；优选地，所述微生物为
11.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于：所述AHAS包括ilvBN、ilvGM和ilvIH；
12.利用权利要求7-11任一项所述构建方法得到的L-缬氨酸工程菌。
13.权利要求12所述的L-缬氨酸工程菌在L-缬氨酸生产中的应用。
14.一种生产L-缬氨酸的方法，包括下述步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种mrec突变体，其为由seq id no.:3所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的mrec突变体，其特征在于，所述mrec突变体为seq id no.:2所示的杆状决定蛋白氨基酸序列第150位的脯氨酸突变为亮氨酸后所得的蛋白质。
3.编码权利要求1所述mrec突变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为(a1)或(a2)所述的dna分子：
5.一种生物材料，其为下述(b1)-(b3)中任一种：
6.下述(c1)-(c2)中的任一种应用：
7.一种l-缬氨酸工程菌的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：向微生物中导入权利要求3或4所述核酸分...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，郭恒华，刘萍萍，张冬竹，唐金磊，刘树蓬，
申请(专利权)人：安徽华恒生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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