【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种苏氨酸脱氨酶突变体及其在异亮氨酸制备中的应用。
技术介绍
1、l-异亮氨酸属于支链氨基酸(branched chain amino acid，bcaa)，是人与动物自身不能合成而必需以来外源供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
2、l-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，目前在工业生产上实施的只有发酵法。在发酵法使用的微生物中，l-异亮氨酸的合成途径及调控方式较复杂，苏氨酸脱氨酶是l-异亮氨酸生物合成的关键酶，是异亮氨酸合成的限速步骤，也是发酵法高效生产l-异亮氨酸及其衍生物的关键限制因素。苏氨酸脱水酶亦称苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)此酶催化苏氨脱水分解生成氨和α-酮丁酸的反应，编码该酶的基因为ilva。
3、ilva基因编码的苏氨酸脱氨酶btd_ilva主要有3个结构域，分别为n端的催化结构域(palp)和c端的两个调控结构域(act_like)。苏氨酸作为底物可以与ilva的palp结构域对接，而异亮氨酸与ilva的c端调控域结合后，会对ilva形成反馈抑制，抑制其与底物苏氨酸的结合。人们希望通过对ilva结构的研究从而提高其与底物的亲和力，或者解决反馈抑制，进而提高ilva基因表型的活性。
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术人通
2、本专利技术提供了一种突变的ilva基因、含有该突变基因的表达载体，以及含有该基因的工程菌，及其在提高异亮氨酸产量及发酵生产中的应用。
3、本专利技术的第一个方面，涉及一种多核苷酸分子，包括实质上该核酸分子编码解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶，所述苏氨酸脱氨酶是相对于野生型具有氨基酸水平的突变的基因。
4、在一个实施例中，所述实质上解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因是突变的ilva基因。本专利技术ilva基因相较于野生型ilva基因(核苷酸序列如seq no.1所示；氨基酸序列如seq no.2所示)发生变异(核苷酸序列为seq no.3,5或7所示)，该变异解除了l-异亮氨酸对ilva基因编码的反馈抑制的变异，例如h418y或h418f或h418w，分别如本申请seq no.4,6,8所示。
5、本专利技术还涉及一种基因工程菌株，所述菌株包含突变的苏氨酸脱氨酶的基因。
6、在一个实施例中，所述解除了l-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因可以是突变的ilva基因。
7、如上所述基因工程菌，可以将本专利技术的ilva基因插入到载体dna后，再导入宿主内。本专利技术的ilva基因可以作为质粒类染色体外dna保留在宿主内，也可以通过利用转导作用、易位子、mu噬菌体或同源性重组的方法将上述基因编入宿主微生物的染色体内。为了有效地进行上述基因的表达，可以将本专利技术的ilva置于lac、trp、pl和tac等在微生物内起作用的启动子控制之下。
8、在一个实施例中，所述含有突变的ilva基因的异亮氨酸发酵工程菌株具有比含有野生型ilva基因的工程菌株高43％的异亮氨酸产率。
9、本专利技术所述基因工程菌株可以用于发酵生产l-异亮氨酸。
10、与现有技术相比，本专利技术具有下述有益技术效果：
11、1、本专利技术提供了一种突变的ilva基因及其编码核酸序列
12、2、本专利技术提供了一种提高异亮氨酸产量的方法，通过在重组菌株中表达突变的ilva基因从而提高异亮氨酸的发酵产量，并将其用于l-异亮氨酸工程菌株的构建和l-异亮氨酸的高效发酵。含有ilva h418w的基因工程菌株相对于含有野生型ilva基因的菌株l-异亮氨酸生产能力增加了43％，具有重大的产业应用价值。
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1.一种ilvA基因突变体，其特征在于：与野生型相比在氨基酸序列的418位具有突变。
2.根据权利要求1所述的ilvA基因突变体，其特征在于：所述突变为H418Y或H418F或H418W。
3.根据权利要求2所述的ilvA基因突变体，其特征在于：所述突变体氨基酸序列为序列表Seq No.4,6,8所示。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-3所述的变体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：多核苷酸序列如序列表Seq No.3,5或7所示。
6.一种表达载体，其含有编码权利要求1-3所述的变体的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述多核苷酸如序列表Seq No.3,5或7所示。
8.一种重组菌株，其包含根据权利要求1-3所述的变体或编码所述变体的多核苷酸，或含有所述变体的多核苷酸的表达载体以及所述菌株在制备异亮氨酸中的用途。
9.根据权利要求1-3所述的变体、权利要求4-5所述的多核苷酸，或权利要求6-7的表达载体在制备异亮氨酸重组菌株的应用。p>
10.一种提高异亮氨酸产量的方法，其特征在于：所用菌株中含有ilvA基因的突变体，所述突变为在野生型ilvA氨基酸序列的418位。
...【技术特征摘要】
1.一种ilva基因突变体，其特征在于：与野生型相比在氨基酸序列的418位具有突变。
2.根据权利要求1所述的ilva基因突变体，其特征在于：所述突变为h418y或h418f或h418w。
3.根据权利要求2所述的ilva基因突变体，其特征在于：所述突变体氨基酸序列为序列表seq no.4,6,8所示。
4.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-3所述的变体。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：多核苷酸序列如序列表seq no.3,5或7所示。
6.一种表达载体，其含有编码权利要求1-3所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小溪，张彧，张勇，陈璐，石玉松，唐严严，
申请(专利权)人：安徽华恒生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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