【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、法布里病是一种罕见的进行性先天性代谢疾病，其由gla基因突变导致溶酶体酶α-半乳糖苷酶a(α-gal)缺乏引起。如果不进行治疗，法布里病患者的预期寿命会缩短，通常在四十或五十岁左右因影响肾脏、心脏和/或中枢神经系统的血管疾病而死亡。
2、α-gal酶活性的缺乏导致其主要底物神经酰胺三己糖苷(gb3)及其脱乙酰化可溶形式三聚己糖鞘氨醇(lysogb3)的进行性系统性积累，从而导致无数的健康问题，包括一种或多种肾疾病、心脏疾病和/或脑血管疾病，伴随缩短预期寿命。根据突变和残余α-gal酶水平，该疾病在儿童期/青春期表现为典型的早发性法布里病，或在以后的生活中表现为衰减(成人)形式。当残留酶活性<5％时，发生典型法布里病(arends m等人(2017)plos one 12(8):e0182379)并且通常发生在男性中。
3、法布里病也与疼痛的发展有关。疼痛可能是由背根神经节和交感神经节中的脂质沉积或小纤维神经病变引起的。一般来说，疼痛是慢性的或是阵发性的中任一种。法布里病的阵发性疼痛称为“法布里危象”，通常始于四肢并向近端放射，可能由运动、疾病、温度变化或其他身体和情绪压力引发。这种神经病性疼痛也与缺乏温度感知有关。
4、目前批准的法布里病的特异性治疗是酶替代疗法(“ert”)，其涉及用两种版本的重组人α-gal种任一者治疗患者：半乳糖苷酶α(其由培养的人细胞系产生)和半乳糖苷酶β(其由gla基因转导的中国仓鼠卵巢细胞产生)。尽管ert在许多情况下是有效的，但这种治疗需要终
技术实现思路
1、本申请公开了用于治疗和/或预防法布里病的方法和组合物。本公开部分提供了使用重组腺相关病毒载体(raav)来介导gla基因转移和表达的基因疗法方法。本申请基于以下发现：基因递送媒介物诸如raav载体具有广泛组织向性并利用遍在启动子(ubiquitous promoter)驱动广泛的基因表达，这导致持续高水平的蛋白质表达和大量的蛋白质暴露于广泛的组织和/或gb3或lysogb3水平的降低。本申请还基于以下发现：使用具有广泛或组织特异性向性的raav载体并利用遍在启动子或组织特异性启动子递送的gla密码子优化的或工程化的变体导致体内α-gal活性增加和/或体内lysogb3或gb3水平降低。此外，这种驱动编码具有增加的半衰期和改善的细胞摄取的α-gal蛋白的gla变体表达的基因递送方法进一步增加了关键靶组织中α-gal的暴露。总的来说，这些发现允许本文所述的递送媒介物实现施用的转基因的广泛组织分布，并且还允许更好的治疗结果。包含本文所述的gla序列的递送媒介物特别适用于治疗法布里病。
2、本文描述了用于将α-半乳糖苷酶a(gla)基因有效递送至有需要的受试者的细胞中的方法和组合物。递送的gla转基因导致α-gal蛋白的表达。本公开部分基于重组腺相关病毒(raav)载体的开发，所述载体包含α-半乳糖苷酶a(gla)基因等，并且一旦存在于细胞中，其表现出大量的α-gal蛋白表达。本公开至少部分基于以下令人惊讶的发现：在遍在启动子下包含gla基因并包装在具有广泛组织向性的raav衣壳中的构建体即使在低剂量下也导致肾脏、心脏、胃肠道、脑和外周神经元中持续的α-gal蛋白表达和大量的组织生物分布。使用该载体获得的广泛分布允许将α-gal有效递送至受法布里病影响的组织，并因此允许稳健的治疗结果。
3、本文描述的raav载体可以与具有野生型序列(seq id no:3)的gla基因或具有本文所述的修饰序列的gla基因一起使用。这种修饰的gla序列包括例如密码子优化的gla和/或gla的工程化变体。本文所述的raav载体允许各种组织中的三聚己糖鞘氨醇(lysogb3)和/或神经酰胺三己糖苷(gb3)的底物清除。
4、如下文更详细描述的，本文所述的基因疗法系统导致健康的总体改善，这由法布里病小鼠模型中的体重增加、肾脏功能和神经症状改善所证实，并且进一步预期在人类中引起相同的结果。本文提供的方法和组合物可用于在受法布里病影响的多种组织中实现gla的持续表达。因此，本申请提供了在治疗法布里病和减轻相关症状方面高度有效的组合物和方法。
5、在一些方面，提供了具有广泛组织向性的重组腺相关病毒(raav)载体，所述载体包含：(a)5’末端反向重复(itr)；(b)遍在启动子；(c)编码α-gal酶的核苷酸序列；(d)多聚腺苷酸；以及(e)3’itr。
6、在一些方面，提供了具有广泛组织向性的重组腺相关病毒(raav)载体，所述载体包含：(a)5’末端反向重复(itr)；(b)遍在启动子；(c)编码α-gal酶的核苷酸序列；(d)土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)；(e)多聚腺苷酸；以及(f)3’itr。
7、具有广泛组织向性(术语“广泛组织向性(broad tissue tropism)”“宽向性(wide-tropism)”在本文中可互换使用)的各种aav衣壳可用于本文所述的raav载体中。例如，在一些实施方案中，aav衣壳是选自以下的宽向性aav衣壳：aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav4衣壳、aav5衣壳、aav6衣壳、aav7衣壳、aav8衣壳、aav9衣壳、aav11、aav12、aav13、aavhu.37、aavrh.8、aavrh.10和aavrh.39、aav-dj或aav-dj/8。
8、因此，在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav1。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav2。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav3。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav4。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav5。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav6。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav7。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav8。在一些实施方案中，具有宽向性的aav衣壳是aav，是aav9。
9、在curr opin vir2016年12月21:75-80中描述了各种衣壳和相关的向性，其内容通过引用并入本文。“广泛组织向性”意指衣壳能够使基因转移到两种或超过2、3、4、5、6、7、8种或更多种组织类型中。例如，在一些实施方案中，具有广泛组织向性的衣壳能够将基因转移到一种或多种以下组织：受试者的肝脏、肾脏、心脏、胃肠道和/或外周神经元。
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【技术保护点】
1.一种包装在具有广泛组织向性的AAV衣壳中的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述载体包含
2.一种包装在具有广泛组织向性的AAV衣壳中的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述载体包含
3.如权利要求1或2所述的重组rAAV载体，其中所述AAV衣壳是选自以下的宽向性AAV衣壳：AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳或AAV9衣壳。
4.如权利要求3所述的重组rAAV载体，其中所述宽向性AAV衣壳是AAV9。
5.如权利要求1所述的rAAV载体，其中所述遍在启动子选自鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、EF-1α启动子、PGK启动子、UBC启动子、LSEβ-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子或遍在染色质开放元件(UCOE)启动子。
6.如权利要求1所述的rAAV载体，其中所述遍在启动子包含巨细胞病毒(CMV)增强子、鸡β肌动蛋白启动子和兔β珠蛋白内含子。
7.如权利要求1所述的rAAV载体，其中所述遍在启动子包含缩短的EF-1α启动子和一个或多个内含
8.如权利要求7所述的rAAV载体，其中所述一个或多个内含子来自鸡β肌动蛋白和/或兔β珠蛋白基因。
9.如权利要求4所述的rAAV载体，其中所述AAV9衣壳是天然存在的或修饰的。
10.如权利要求2所述的rAAV载体，其中所述WPRE序列是修饰的。
11.如权利要求10所述的rAAV载体，其中所述WPRE序列是WPRE mut6delATG。
12.如权利要求1或2所述的rAAV载体，其中所述多聚腺苷酸是牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的rAAV载体，其中编码α-GAL酶的所述核苷酸序列是密码子优化的。
14.如权利要求13所述的rAAV载体，其中编码α-GAL酶的所述核苷酸序列是针对人细胞而密码子优化的。
15.如权利要求1至13中任一项所述的rAAV载体，其中所述α-GAL酶具有未修饰的序列。
16.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的重组腺相关病毒载体(rAAV)。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的rAAV载体。
18.一种细胞，其包含权利要求1至15中任一项所述的rAAV载体。
19.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包装在具有广泛组织向性的衣壳中的重组腺相关病毒载体(rAAV)，所述载体包含：
20.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包装在具有广泛组织向性的衣壳中的重组腺相关病毒载体(rAAV)，所述载体包含：
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述AAV衣壳是选自以下的宽向性AAV衣壳：AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳、AAV8衣壳或AAV9衣壳。
22.如权利要求21所述的重组rAAV载体，其中所述宽向性AAV衣壳是AAV9。
23.如权利要求19或20所述的方法，其中编码α-GAL酶的所述核苷酸序列是密码子优化的。
24.如权利要求19或20所述的方法，其中编码α-GAL酶的所述核苷酸序列是工程化的。
25.如权利要求24所述的方法，其中编码α-GAL酶的所述核苷酸序列是工程化的和密码子优化的。
26.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述α-GAL酶具有未修饰的序列。
27.如权利要求20所述的方法，其中所述WPRE是WPRE mut6delATG。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述多聚腺苷酸是牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸。
29.如权利要求19至28中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体是通过静脉内、皮下或经皮施用来施用。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述经皮施用通过基因枪进行。
31.如权利要求19至30中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体在施用后是游离型的。
32.如权利要求19或20所述的方法，其中与使用肝脏特异性启动子特异性靶向肝脏的包含AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV3衣壳、AAV4衣壳、AAV5衣壳、AAV6衣壳、AAV7衣壳或AAV8衣壳的rAAV载体相比，所述rAAV载体以较低的剂量实现治疗效果。
33.如权利要求19至32中任一项所述的方法，其...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包装在具有广泛组织向性的aav衣壳中的重组腺相关病毒(raav)载体，所述载体包含
2.一种包装在具有广泛组织向性的aav衣壳中的重组腺相关病毒(raav)载体，所述载体包含
3.如权利要求1或2所述的重组raav载体，其中所述aav衣壳是选自以下的宽向性aav衣壳：aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav4衣壳、aav5衣壳、aav6衣壳、aav7衣壳、aav8衣壳或aav9衣壳。
4.如权利要求3所述的重组raav载体，其中所述宽向性aav衣壳是aav9。
5.如权利要求1所述的raav载体，其中所述遍在启动子选自鸡β肌动蛋白(cba)启动子、ef-1α启动子、pgk启动子、ubc启动子、lseβ-葡糖醛酸糖苷酶(gusb)启动子或遍在染色质开放元件(ucoe)启动子。
6.如权利要求1所述的raav载体，其中所述遍在启动子包含巨细胞病毒(cmv)增强子、鸡β肌动蛋白启动子和兔β珠蛋白内含子。
7.如权利要求1所述的raav载体，其中所述遍在启动子包含缩短的ef-1α启动子和一个或多个内含子。
8.如权利要求7所述的raav载体，其中所述一个或多个内含子来自鸡β肌动蛋白和/或兔β珠蛋白基因。
9.如权利要求4所述的raav载体，其中所述aav9衣壳是天然存在的或修饰的。
10.如权利要求2所述的raav载体，其中所述wpre序列是修饰的。
11.如权利要求10所述的raav载体，其中所述wpre序列是wpre mut6delatg。
12.如权利要求1或2所述的raav载体，其中所述多聚腺苷酸是牛生长激素(bgh)多聚腺苷酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的raav载体，其中编码α-gal酶的所述核苷酸序列是密码子优化的。
14.如权利要求13所述的raav载体，其中编码α-gal酶的所述核苷酸序列是针对人细胞而密码子优化的。
15.如权利要求1至13中任一项所述的raav载体，其中所述α-gal酶具有未修饰的序列。
16.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用前述权利要求中任一项所述的重组腺相关病毒载体(raav)。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1至15中任一项所述的raav载体。
18.一种细胞，其包含权利要求1至15中任一项所述的raav载体。
19.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包装在具有广泛组织向性的衣壳中的重组腺相关病毒载体(raav)，所述载体包含：
20.一种治疗法布里病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包装在具有广泛组织向性的衣壳中的重组腺相关病毒载体(raav)，所述载体包含：
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述aav衣壳是选自以下的宽向性aav衣壳：aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav4衣壳、aav5衣壳、aav6衣壳、aav7衣壳、aav8衣壳或aav9衣壳。...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·伊斯兰，M·R·德施潘得，M·纳塔拉詹，朴隆熙，V·乔，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：
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