【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体的修饰体，进一步详细而言，涉及通过修饰而提高了硫氧还蛋白活性以及其药理作用的稳定性及安全性的融合体。
技术介绍
1、硫氧还蛋白(trx)于1964年作为大肠杆菌的核糖核苷酸还原酶的辅酶被发现(非专利文献1)。另外，已知在20世纪80年代后期，淀井等人通过基因克隆发现人trx与成人t细胞白血病源性因子(atl-derived factor：adf)为同源体，其中，adf被报告为白细胞介素2受体α链的诱导因子(非专利文献2)。
2、trx在人中由第9号染色体的txn基因编码为分子量约为14,000的蛋白质，在所有生物物种的各种细胞中表达。对于人而言，trx基因的功能丧失型突变体在胚胎发生早期的四细胞期的时间点已经致死。trx具有-cys-gly-pro-cys-这一活性部位，由紫外线、放射线、氧化剂、病毒感染、缺血再灌注损伤、施予抗癌药等各种因素引起的氧化应激而被诱导表达，去除细胞内的活性氧类，发挥抗氧化作用(非专利文献1及3)。另外，具有细胞因子、核因子-κb(nuclear factor-κb：nf-κb)、凋亡信号调节激酶1(apoptotic signal-regulating kinase-1：ask-1)等转录因子的活性控制，以及抑制抗凋亡作用、抑制炎症性细胞因子、人巨噬细胞移动抑制因子(human macrophage migration inhibitory factor：mif)的抗炎作用等药理活性(非专利文献4～7)。
3、另外，人血清白蛋白(h
4、该hsa的血液中的半衰期为14～21天，与hsa结合的低分子化合物不会被器官摄取，因此能够不被代谢·排泄而在血液中循环。如上所述，trx虽然表现出各种药理作用，但是在作为药物施予时，迅速在肾小球滤过，因此血液中的半衰期短至约1小时，因此，为了维持血药浓度而得到治疗效果，需要定速静脉内施予、频繁施予。
5、此前，专利技术人中的一部分报告了使用白蛋白融合技术(专利文献1)使hsa融合于trx(hsa-trx)，由此，能够使血液中的半衰期达到1小时至10小时，从而能够延长血液中的滞留时间(非专利文献8)。另外，报告了该hsa-trx在各种病况模型中的效果。例如，报告了在顺铂肾病(非专利文献9)、对乙酰氨基酚诱发的肝损伤(非专利文献10)、博来霉素诱发的肺纤维化(非专利文献11)及流感病毒诱发的肺损伤(非专利文献12)等病况模型中，经单次或低频率的施予显示出有效的治疗效果。
6、trx是由105个氨基酸残基形成的蛋白质，具有被称为硫氧还蛋白折叠(thioredoxin fold)的结构，具有催化二硫(s-s)键的形成、异构化的酶中共通包含的α-螺旋和β-折叠这二者。并且，trx为4个β-折叠夹在2个α-螺旋中的结构。
7、trx具有5个半胱氨酸残基，且均为游离巯(sh)基。自n端起第32位和第35位的cys32和cys35是trx的氧化还原活性的中心，并且是ask-1结合的调整部位。其余的自n端起第62位、第69位及第73位的cys62、cys69及cys73是担负别构效应的部位，cys69为亚硝基化部位，cys62和cys69附近是硫氧还蛋白还原酶(trxr)的结合部位，当cys62与cys69进行二硫键合时，trxr不能结合。cys73是谷胱甘肽加成部位，并且是与trx的二聚体化相关的部位(非专利文献13)。据报告，由丝氨酸取代了csy32及cys35的修饰体表现出迅速向细胞内移动的性质，具有高的细胞增殖抑制活性(专利文献2)。另外，还有报告称，若由丝氨酸取代cys62、cys69及cys73，则与野生型相比，trx活性(还原活性)下降(非专利文献14)。有报告称，trx具有的活性中心的半胱氨酸残基不进行修饰、将除此以外的半胱氨酸基中的至少1个或全部取代为其他的氨基酸残基，从而使其在非还原条件下稳定(专利文献3)。
8、另一方面，hsa是由585个氨基酸残基形成的单纯蛋白质，由结构域i(1～195残基)、结构域ii(196～383残基)及结构域iii这3者折叠的相同区域构成，并且，它们分别具有亚结构域a及b，iia(sitei)及iiia(siteii)是多数药物进行结合的部位，在n端侧有金属进行结合的部位。在分子内，具有17对二硫(s-s)键，仅自n端起第34位的半胱氨酸残基(cys34)具有游离巯(sh)基。该游离巯基残基为游离状态的hsa称为还原型hsa、形成二硫键的称为氧化型hsa，氧化型hsa是各种疾病的标志物。另外，zhao等人发现，干扰素-α2b(ifn-alpha2b)与hsa的融合蛋白(ifn-alpha2b-hsa)通过由丝氨酸取代hsa的cys34能够抑制凝集体的形成，并且热稳定性也增加(非专利文献15)。
9、现有技术文献
10、专利文献
11、专利文献1：ep0399666a1
12、专利文献2：wo2004/087917a1
13、专利文献3：日本特开平10-191977
14、非专利文献
15、非专利文献1：holmgren a,thioredoxin.ann rev biochem 54(1985)237-271
16、非专利文献2：tagaya y等，atl-derived factor(adf),an il-2receptor/tacinducer homologous to thioredoxin；possible involvement of dithiol-reductionin the il-2receptor induction.embo j 8(1989)757-764
17、非专利文献3：nakamura h等，redox regulation of cellular activation.annurev immunol 15(1997)351-369
18、非专利文献4：chen b等，thioredoxin 1downregulates mcp-1secretion andexpression in human endothelial cells by suppressing nuclear translocation ofactivator protein 1and redox factor-1.am jphysiol cell physiol 298(2010)c1170-c1179
19、非专利文献5：ohsahi s等，overexpression of redox-active proteinthioredoxin-1prevents development of chron本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其是经修饰的血清白蛋白与硫氧还蛋白的融合体，其特征在于，
2.如权利要求1所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，所述硫氧还蛋白是其氨基酸序列中的自N端起第62位或与其等同的位置的半胱氨酸及/或第69位或与其等同的位置的半胱氨酸进一步被其它氨基酸取代而成的。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，所述血清白蛋白是其氨基酸序列中的自N端起第34位或与其等同的位置的半胱氨酸被其它氨基酸取代而成的。
4.如权利要求1～3中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸是中性氨基酸。
5.如权利要求1～4中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸选自丙氨酸、丝氨酸、及甘氨酸。
6.如权利要求1～5中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸为丙氨酸。
7.如权利要求1～6中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其
8.如权利要求7所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸为丙氨酸。
9.如权利要求1～8中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其是血清白蛋白与硫氧还蛋白通过接头结合而成的。
10.医药组合物，其包含权利要求1～9中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其用于能够通过抗氧化作用、细胞因子转录因子的活性控制、抗凋亡及抗炎作用的药理活性治疗的疾病的预防或治疗。
12.如权利要求11所述的医药组合物，其中，所述疾病为酒精性肝病、非酒精性肝病、对乙酰氨基酚肝炎、急性重型肝炎、肝硬化、急性肾损伤、慢性肾损伤、顺铂肾病、横纹肌溶解症、造影剂肾病、慢性肾脏病、糖尿病性肾脏病、器官纤维化、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、周围神经病、脑梗死、动脉硬化、心肌梗死、心力衰竭、心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、过敏性肺炎、流感病毒肺炎、支气管哮喘。
13.权利要求1～9中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体用于制造医药组合物的用途。
14.权利要求1～9中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体用于预防或治疗能够通过抗氧化作用、细胞因子转录因子的活性控制、抗凋亡及抗炎作用的药理活性治疗的疾病的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其中，所述疾病为酒精性肝病、非酒精性肝病、对乙酰氨基酚肝炎、急性重型肝炎、肝硬化、急性肾损伤、慢性肾损伤、顺铂肾病、横纹肌溶解症、造影剂肾病、慢性肾脏病、糖尿病性肾脏病、器官纤维化、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、周围神经病、脑梗死、动脉硬化、心肌梗死、心力衰竭、心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺疾病、过敏性肺炎、流感病毒肺炎、支气管哮喘。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其是经修饰的血清白蛋白与硫氧还蛋白的融合体，其特征在于，
2.如权利要求1所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，所述硫氧还蛋白是其氨基酸序列中的自n端起第62位或与其等同的位置的半胱氨酸及/或第69位或与其等同的位置的半胱氨酸进一步被其它氨基酸取代而成的。
3.如权利要求1或2所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，所述血清白蛋白是其氨基酸序列中的自n端起第34位或与其等同的位置的半胱氨酸被其它氨基酸取代而成的。
4.如权利要求1～3中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸是中性氨基酸。
5.如权利要求1～4中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸选自丙氨酸、丝氨酸、及甘氨酸。
6.如权利要求1～5中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸为丙氨酸。
7.如权利要求1～6中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，所述硫氧还蛋白的氨基酸序列中的自n端起第62位或与其等同的位置的半胱氨酸及/或第69位或与其等同的位置的半胱氨酸进一步被其它氨基酸取代，并且，
8.如权利要求7所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其中，取代所述半胱氨酸的氨基酸为丙氨酸。
9.如权利要求1～8中任一项所述的经修饰的血清白蛋白-硫氧还蛋白融合体，其是血清白蛋白与硫氧还蛋白通过接头结合而...
【专利技术属性】
技术研发人员：松田纯一，西田健人，平嶋正树，丸山彻，渡边博志，前田仁志，
申请(专利权)人：KM生物医药股份公司，
类型：发明
国别省市：
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