【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及调控大肠杆菌糖代谢合成倍半萜的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
1、作为一类结构丰富、种类繁多的天然产物，倍半萜是医药、食品、化妆品、能源等领域的重要原料。例如，广藿香醇是一种天然的三环倍半萜化合物，有木质香味，常用于化妆品领域，可制成香水和护肤品添加剂；也常用于医药领域，具有消炎止疼，治疗抑郁症、病毒感染和癌症的作用。τ-杜松醇一般用于医药和农业领域，对革兰氏阳性菌具有抗菌活性、抗真菌活性和抗霉菌活性，常作为治疗伤口致病菌的药物；还可以治疗腹泻，缓解胃痉挛；对多种癌细胞有细胞毒性。由于倍半萜化合物的多种重要用途，现今市场对其需求量逐年上升；然而从植物中提取倍半萜存在植物资源不足、成本高、产率低的问题。开发微生物发酵制备倍半萜的方法，将有利于提高其产量、降低成本，实现大规模工业化生产。
2、大肠杆菌(escherichia coli)营养需求简单，可利用廉价的培养基生长并易获得高密度菌体，具有发酵周期短、发酵产量高和生产强度高等优点。同时，e.coli遗传背景清晰，基因工程操作手段成熟；与酵母菌相比，e.coli不需要合成麦角固醇、类胡萝卜素等竞争利用fpp前体的物质，更利于合成不需要复杂后修饰作用的萜类化合物。另一方面，重组e.coli合成多种倍半萜过程中都产生被葡萄糖抑制的作用，出现“too much of a goodthing can be bad”的现象，是制约倍半萜化合物大规模发酵合成的瓶颈问题。例如，充足的葡萄糖碳源导致菌体快速生长，但不利于广藿香醇合成。相反，在极低的葡萄糖供应速率下，
3、次级代谢产物往往在营养物质耗尽时合成，受葡萄糖等碳源的抑制，这一现象往往是由碳源分解代谢物阻遏效应(ccr)导致的，具体调控机制因次级代谢产物和碳源的种类而异。葡萄糖分解代谢产生的葡萄糖-6-磷酸(g6p)、果糖-1,6-二磷酸(fdp)、环磷酸腺苷(camp)等信号分子可直接或者间接调节次级代谢产物合成代谢途径中关键酶的表达或者活性，从而抑制次级代谢产物的合成。然而，尚无ccr抑制异源倍半萜合成代谢途径酶活性的相关报道。此外，葡萄糖分解代谢信号分子还对细胞全局代谢有重要的调节作用。例如，camp积累水平可以影响e.coli细胞应激反应以及乙酰-coa代谢、细胞生长性能，以及异源萜类化合物的合成能力。进一步精细、系统调控相关代谢途径也将深入揭示倍半萜类化合物发酵合成的调控机制。
4、e.coli以葡萄糖为碳源的代谢过程中，在低浓度葡萄糖环境，呼吸作用充分，代谢副产物积累少，菌体生长速率也低；而高葡萄糖环境，代谢过速导致乙酸等代谢副产物大量积累。代谢副产物的积累不仅浪费碳源，还会严重抑制菌体生长，导致目的产物的产量、转化率、合成速率降低。当葡萄糖是唯一限制性营养物质时，通过严格控制补糖速度将发酵液中残糖控制在极低浓度(比生长速率控制在0.27 1/h以下)，并且提供充足的氧，可将乙酸合成量限制在较低水平，实现高密度发酵。然而，这种苛刻的培养条件在大规模发酵过程中难以操作或者不能实现。因此，对葡萄糖代谢过程进行动态调节，适时开启或者关闭糖代谢，协调菌体生长和代谢产物合成过程，更加符合实际应用需要。
技术实现思路
1、针对目前倍半萜合成受到糖代谢抑制的现象，本专利技术探究葡萄糖分解代谢产物对广藿香醇发酵合成的作用，构建基于丙酮酸感应的葡萄糖代谢调控系统协调代谢过速和广藿香醇以及τ-杜松醇的合成，获得高效合成倍半萜的重组大肠杆菌底盘细胞，以期提高广藿香醇、τ-杜松醇的产量，降低成本，并促进倍半萜的大规模发酵生产。
2、本专利技术提供了提高大肠杆菌合成倍半萜类化合物的方法，所述方法包括：
3、(1)调节碳源补料速率；
4、(2)减弱camp合成代谢途径；
5、在一种实施方式中，所述减弱camp合成代谢途径包括：敲除或沉默cyaa基因。
6、在一种实施方式中，所述倍半萜类化合物包括但不限于广藿香醇、τ-杜松醇。
7、在一种实施方式中，所述大肠杆菌以大肠杆菌050h为出发菌株；所述大肠杆菌050h公开于论文：journal of agricultural and food chemistry,2021,69,7572-7580中。
8、本专利技术还提供了丙酮酸感应糖代谢调控系统，包括第一启动子、丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr、第二启动子和操纵基因；所述第二启动子调控操纵基因的表达；所述第一启动子调控丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr的表达；所述丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr位于第二启动子的上游。
9、在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr末端具有自降解标签das+4(seq id no.12所示)。
10、在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr的genbank登录号：wp_011497802.1。
11、在一种实施方式中，所述操纵基因为seq id no.8所示的操纵基因a5。
12、在一种实施方式中，所述操纵基因是在a5的基础上进行了突变。
13、在一种实施方式中，所述突变包括但不限于seq id no.9～11任一所示的核苷酸序列。
14、在一种实施方式中，所述第一启动子包括启动子ptac、启动子pj23101和启动子pj23100；所述第二启动子包括启动子pj23101和启动子pj23100。
15、在一种实施方式中，所述第一启动子为启动子ptac(seq id no.1所示)；所述第二启动子为启动子pj23100(seq id no.2所示)。
16、在一种实施方式中，所述第一启动子为启动子pj23100；所述第二启动子为启动子pj23100。
17、在一种实施方式中，所述第一启动子为启动子pj23101(seq id no.3所示)；所述第二启动子为启动子pj23100。
18、在一种实施方式中，所述第一启动子为启动子pj23100；所述第二启动子为启动子pj23101。
19、在一种实施方式中，所述第一启动子为启动子pj23101；所述第二启动子为启动子pj23101。
20、在一种实施方式中，所述操纵基因的下游含有调节蛋白sgrt的编码基因(seq idno.14所示)。
21、在一种实施方式中，所述调节本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.提高大肠杆菌合成倍半萜化合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)和/或(b)：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌以大肠杆菌050H为出发菌株。
3.一种丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，包括第一启动子、丙酮酸脱氢酶调节因子SdPdhR、第二启动子和操纵基因；所述第二启动子调控操纵基因的表达；所述第一启动子调控丙酮酸脱氢酶调节因子SdPdhR的表达；所述丙酮酸脱氢酶调节因子SdPdhR位于第二启动子的上游；所述第一启动子包括启动子Ptac、启动子PJ23101和启动子PJ23100；所述第二启动子包括启动子PJ23101和启动子PJ23100；所述操纵基因包括SEQ ID NO.8所示的操纵基因A5。
4.根据权利要求3所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，所述丙酮酸脱氢酶调节因子SdPdhR末端具有自降解标签DAS+4。
5.根据权利要求1或2所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，所述操纵基因是在A5的基础上进行了突变；突变后的操纵基因具有包括SEQ ID NO.9～11任一所示的核苷酸序
6.根据权利要求3～5任一所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，所述操纵基因的下游含有调节蛋白SgrT的编码基因。
7.根据权利要求6所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，所述基因SgrT的N端还融合有ZZ多肽标签，C端融合有DAS+4标签。
8.含有权利要求3～7任一所述丙酮酸感应糖代谢调控系统的重组微生物细胞。
9.权利要求3～7任一所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统在动态调控糖代谢发酵合成倍半萜化合物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述倍半萜化合物包括广藿香醇或τ-杜松醇。
...【技术特征摘要】
1.提高大肠杆菌合成倍半萜化合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)和/或(b)：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌以大肠杆菌050h为出发菌株。
3.一种丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，包括第一启动子、丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr、第二启动子和操纵基因；所述第二启动子调控操纵基因的表达；所述第一启动子调控丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr的表达；所述丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr位于第二启动子的上游；所述第一启动子包括启动子ptac、启动子pj23101和启动子pj23100；所述第二启动子包括启动子pj23101和启动子pj23100；所述操纵基因包括seq id no.8所示的操纵基因a5。
4.根据权利要求3所述的丙酮酸感应糖代谢调控系统，其特征在于，所述丙酮酸脱氢酶调节因子sdpdhr末端具有自降解...
【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，周丽，李云燕，张慧，张新蕊，杨诗怡，蒋紫怡，王梦轩，黎君，王沁，韩来闯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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