【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑，是一种在dna的gc基序上实现高效c/g到t/a编辑的高保真lncbe系统。
技术介绍
1、线粒体疾病是一类严重危害人类健康可致残致死的母性遗传疾病，如线粒体脑肌病、共济失调等。线粒体疾病常由细胞核基因突变和线粒体dna突变引起，特别地，针对线粒体dna(mtdna)突变造成的线粒体疾病更是束手无策，其中最重要的原因是缺少线粒体基因编辑工具构建线粒体疾病动物模型，以开展系统的分子机制研究和治疗方法探索。
2、由于rna无法进入线粒体，因此现有的基于crispr的编辑工具无法用来编辑mtdna。通过融合线粒体定位信号肽的限制性内切酶、mito-zfn和mito-talen可以对突变的mtdna引入dna双链断裂(dsb)，以降低突变mtdna的比例。然而，这些方法不能实现对mtdna进行单个碱基的精准编辑，因此不能用来构建mtdna突变动物疾病模型，也无法用于探索线粒体疾病的精准治疗。
3、来自burkholderia cenocepacia的细菌毒素蛋白的ddda功能域即dddatox具有双链dna脱氨基酶活性，通过和tale相连形成胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)，可以实现线粒体中定点c/g到t/a的突变。但是，原始版本的ddcbe只能对线粒体dna上的“tc”基序中的c进行编辑，通过噬菌体进化得到的ddcbe突变体v6和v11的版本，提高了编辑效率，拓宽了编辑序列偏好性，但是针对“gc”基序中的c编辑的效率依然很低，且会在全线粒体dna上造成脱靶编辑，无法实现精准编辑，同时也会在
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种精确高效的dna胞嘧啶编辑系统lncbe，并且通过dddia抑制其核脱靶编辑，可以实现对“gc”基序中的c进行高效精确编辑。
2、本专利技术的另一目的是提供该系统的应用。
3、本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
4、一种双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域，该ddda结构域为lachnospiraceaebacterium sunii nsj-8来源的双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域，uniprot id为a0a7g9fzy2，基因名简称为fzy2。
5、本专利技术所述的胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域氨基酸序列如seq id no:1所示。
6、编码本专利技术所述的胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域的基因。
7、作为本专利技术的一种优选，所述的胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域的编码基因序列如seq id no:2所示。
8、来自本专利技术所述ddda结构域的分割蛋白，按该ddda的结构域的氨基酸结构特征选择在s100位点进行分割得到一对half ddda的分割蛋白，为：s100n和s100c，分割蛋白成对使用；s100n氨基酸序列如seq id no:3所示，s100c氨基酸序列如seq id no:5所示。
9、编码本专利技术所述的分割蛋白的基因。
10、作为本专利技术的一种优选，编码s100n的核苷酸序列如seq id no:4所示，编码s100c的核苷酸序列如seq id no:6所示。
11、增强版分割蛋白，在上述的分隔蛋白的氨基酸序列中引入突变，用于提高原始蛋白脱氨基酶活性，得到的增强版分割蛋白的氨基酸序列如下所示：s100n-mut1氨基酸序列如seq id no:7所示，s100n-mut2氨基酸序列如seq id no:9所示，s100c-mut3氨基酸序列如seq id no:11所示。
12、编码本专利技术所述的增强版分割蛋白的基因。
13、作为本专利技术的一种优选，s100n-mut1编码基因序列如seq id no:8所示，s100n-mut2编码基因序列如seq id no:10所示；s100c-mut3编码基因序列如seq id no:12所示。
14、本专利技术所述的双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域或其编码基因、所述的分割蛋白或其编码基因、所述的增强版分割蛋白或其编码基因在构建对gc基序中的c实现高效c/g到t/a的高保真编辑系统lncbe中的应用,所述的应用不包含对人的疾病治疗。
15、采用本专利技术所述的编码增强版分割蛋白的基因构建的胞嘧啶编辑系统lncbe。
16、作为本专利技术的一种优选，所述胞嘧啶编辑系统lncbe，包括rvd文库、线粒体定位骨架载体和/或细胞核定位骨架载体，用于实现线粒体dna的c/g到t/a编辑的胞嘧啶编辑系统lncbe采用mts-lncbe骨架载体，用于实现细胞核dna的c/g到t/a编辑的胞嘧啶编辑系统lncbe采用nls-lncbe骨架载体。
17、作为本专利技术的一种优选，5个线粒体定位骨架载体(即mts-lncbe骨架载体)分别为：mts-ccdb-s100n-mut1-ugi、mts-ccdb-s100n-mut2-ugi、mts-ccdb-s100n-ugi、mts-ccdb-s100c-mut3-ugi、mts-ccdb-s100c-ugi；5个细胞核定位骨架载体(即nls-lncbe骨架载体)分别为：nls-ccdb-s100n-mut1-ugi、nls-ccdb-s100n-mut2-ugi、nls-ccdb-s100n-ugi、nls-ccdb-s100c-mut3-ugi、nls-ccdb-s100c-ugi。
18、使用时由于分割蛋白配对使用，因此，相应的线粒体定位骨架载体或细胞核定位骨架载体也应按照s100n-mut1和s100c配对，s100n-mut2和s100c配对，s100n-mut1和s100c-mut3配对，s100n-mut2和s100c-mut3配对的原则配对使用。即：mts-ccdb-s100n-mut1-ugi和mts-ccdb-s100c-ugi配对使用，mts-ccdb-s100n-mut2-ugi和mts-ccdb-s100c-ugi配对使用，mts-ccdb-s100n-mut1-ugi和mts-ccdb-s100c-mut3-ugi配对使用，mts-ccdb-s100n-mut2-ugi和mts-ccdb-s100c-mut3-ugi配对使用；nls-ccdb-s100n-mut1-ugi和nls-ccdb-s100c-ugi配对使用，nls-ccdb-s100n-mut2-ugi和nls-ccdb-s100c-ugi配对使用，nls-ccdb-s100n-mut1-ugi和nls-ccdb-s100c-mut3-ugi配对使用，nls-ccdb-s100n-mut2-ugi和nls-ccdb-s100c-mut3-ugi配对使用。
19、作为本专利技术的一种优选，mts-tale骨架载体的核苷酸序列如seq id no:13所示；nls-tale骨架载体的核苷酸序列如seq id no:1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其特征在于该DddA结构域为Lachnospiraceae bacterium sunii NSJ-8来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，Uniprot ID为A0A7G9FZY2，基因名简称为FZY2。
2.根据权利要求1所述的胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其特征在于该DddA结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.编码权利要求1所述的胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的基因。
4.来自权利要求1所述DddA结构域的分割蛋白，其特征在于，按该DddA的结构域的氨基酸结构特征选择在S100位点进行分割得到一对half DddA的分割蛋白，为：S100N和S100C，分割蛋白成对使用；S100N氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示，S100C氨基酸序列优选如SEQ ID NO:5所示。
5.编码权利要求4所述的分割蛋白的基因。
6.增强版分割蛋白，其特征在于，在权利要求4中所述的分隔蛋白的氨基酸序列中引入突变，用于提高原始蛋白脱氨基酶活性，得到的增强版
7.编码权利要求6所述的增强版分割蛋白的基因。
8.权利要求1所述的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的分割蛋白、权利要求5所述的基因、权利要求6所述的增强版分割蛋白、权利要求7所述的基因在构建对gC基序中的C实现高效C/G到T/A的高保真编辑系统LnCBE中的应用。
9.采用权利要求7所述的基因构建的胞嘧啶编辑系统LnCBE。
10.根据权利要求9所述胞嘧啶编辑系统LnCBE，包括RVD文库、线粒体定位骨架载体和/或细胞核定位骨架载体，其特征在于，用于实现线粒体DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统LnCBE采用MTS-LnCBE骨架载体，用于实现细胞核DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统LnCBE采用NLS-LnCBE骨架载体。
11.根据权利要求10所述胞嘧啶编辑系统LnCBE，其特征在于，5个MTS-LnCBE骨架载体分别为：MTS-ccdb-S100N-mut1-UGI、MTS-ccdb-S100N-mut2-UGI、MTS-ccdb-S100N-UGI、MTS-ccdb-S100C-mut3-UGI、MTS-ccdb-S100C-UGI；5个NLS-LnCBE骨架载体分别为：NLS-ccdb-S100N-mut1-UGI、NLS-ccdb-S100N-mut2-UGI、NLS-ccdb-S100N-UGI、NLS-ccdb-S100C-mut3-UGI、NLS-ccdb-S100C-UGI。
12.根据权利要求11所述胞嘧啶编辑系统LnCBE，其特征在于，MTS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；NLS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；UGI编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
13.一种双链DNA胞嘧啶脱氨基酶免疫抑制蛋白DddIA，其特征在于该蛋白为Lachnospiraceae bacterium sunii NSJ-8来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶免疫抑制蛋白，Uniprot ID为A0A7G9FY10，能够抑制LnCBE编辑系统在核DNA中的脱靶编辑；优选该免疫抑制蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
14.编码权利要求13所述的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶免疫抑制蛋白DddIA的基因。
15.采用权利要求13所述脱氨基酶免疫抑制蛋白DddIA、权利要求14所述的基因构建NLS-FZY2-DddIA载体。
16.根据权利要求15所述的NLS-FZY2-DddIA载体，其特征在于包含细胞核定位骨架载体、Flag标签蛋白及FZY2-DddIA。
17.根据权利要求15所述的NLS-FZY2-DddIA载体，其特征在于，细胞核定位骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；Flag标签蛋白核甘酸序列如SEQ ID NO:21所示。
18.权利要求9-12中任一所述的胞嘧啶编辑系统LnCBE和/或权利要求15-17所述的NLS-FZY2-DddIA载体在线粒体DNA或者细胞核DNA的C/G到T/A编辑中的应用，所述的应用不包含对人的疾病治疗。...
【技术特征摘要】
1.一种双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域，其特征在于该ddda结构域为lachnospiraceae bacterium sunii nsj-8来源的双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域，uniprot id为a0a7g9fzy2，基因名简称为fzy2。
2.根据权利要求1所述的胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域，其特征在于该ddda结构域的氨基酸序列如seq id no:1所示。
3.编码权利要求1所述的胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域的基因。
4.来自权利要求1所述ddda结构域的分割蛋白，其特征在于，按该ddda的结构域的氨基酸结构特征选择在s100位点进行分割得到一对half ddda的分割蛋白，为：s100n和s100c，分割蛋白成对使用；s100n氨基酸序列优选如seq id no:3所示，s100c氨基酸序列优选如seq id no:5所示。
5.编码权利要求4所述的分割蛋白的基因。
6.增强版分割蛋白，其特征在于，在权利要求4中所述的分隔蛋白的氨基酸序列中引入突变，用于提高原始蛋白脱氨基酶活性，得到的增强版分割蛋白的氨基酸序列如下所示：s100n-mut1氨基酸序列如seq id no:7所示，s100n-mut2氨基酸序列如seq id no:9所示，s100c-mut3氨基酸序列如seq id no:11所示。
7.编码权利要求6所述的增强版分割蛋白的基因。
8.权利要求1所述的双链dna胞嘧啶脱氨基酶ddda结构域、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的分割蛋白、权利要求5所述的基因、权利要求6所述的增强版分割蛋白、权利要求7所述的基因在构建对gc基序中的c实现高效c/g到t/a的高保真编辑系统lncbe中的应用。
9.采用权利要求7所述的基因构建的胞嘧啶编辑系统lncbe。
10.根据权利要求9所述胞嘧啶编辑系统lncbe，包括rvd文库、线粒体定位骨架载体和/或细胞核定位骨架载体，其特征在于，用于实现线粒体dna的c/g到t/a编辑的胞嘧啶编辑系统lncbe采用mts-lncbe骨架载体，用于实现细胞核dna的c/g到t/a编辑的胞嘧啶编辑系统lncbe采用nls-lncbe骨架载体。
11.根据权利要求10所述胞嘧啶编辑系统lncbe，其特征在于，5个mts-lncbe骨架载体分别为：mts-ccdb-s100n-mut1-ugi、mts-ccdb-s100n-mut2-ugi、mts-ccdb-s100n-ugi、mts-ccdb-s100c-mut3-ugi、mts-ccdb-s100c-ugi；5个nls-lncbe骨架载体分别为：nls-ccdb-s100n-mut1-ugi、nls-ccdb-s...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈彬，孙海峰，沈李宓妮，冯烨玲，韩露，王兆君，程凯，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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