【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体而言，涉及一种光诱导的相变蛋白元件及其应用。
技术介绍
1、免疫疾病实验室检查项目中对特异性抗体检测是重要的临床诊断标准之一。细胞免疫荧光法(cell-based assays，cba)是检测细胞表面抗原和某些突触蛋白相关自身抗体的首选方法。该方法基于抗原抗体反应，在哺乳动物细胞(hek293、hela或者hep2细胞系)中转染已知的抗原过表达质粒，使得目标抗原在细胞膜或细胞质内表达，过表达抗原的细胞基质与患者的体液样本进行孵育，然后应用针对抗人免疫球蛋白(igg1/igg2/igg3/igg4/igm)的荧光偶联抗体作为二抗进行信号放大和标记，最后通过荧光显微镜或流式细胞仪读取结果。
2、目前神经自身免疫抗体的细胞免疫荧光法检测主要是利用天然的全长基因构建的表达质粒，转染hek293、hep2等哺乳动物细胞制备成检测的材料。例如：titin抗原(mgt30)或者gad65抗原构建到真核表达的载体上用于自身抗体的检测(anti-titinantibodies in myasthenia gravis:tight association with thymoma andheterogeneity of nonthymoma patients.arch neurol.2001jun；58(6):885-90.；gad65neurological autoimmunity.muscle and nerve,2017 56(1),15-27.)。这些抗原蛋白在胞内的表达模式是胞质弥散分布，没有
3、2017年，来自美国普林斯顿大学的研究人员开发出一种被称作optodroplets的工具，其可以利用蓝光调节多价态以促进或逆转体内生物分子凝聚物的形成，他们将光敏感性蛋白标记cry2与促进蛋白相变的内部无序区(intrinsically disordered regions,idr)融合在一起，利用蓝光，研究人员能够诱导这些蛋白缩成一团，从而模拟蛋白在细胞中发生的相变、浓缩过程(spatiotemporal control of intracellular phase transitionsusing light-activated optodroplets.cell.2017jan 12；168(1-2):159-171.e14.)。cry2的主要作用是能够被蓝光诱导发生寡聚化(structural insights into thephotoactivation of arabidopsis cryptochrome 2.nat plants.2020dec；6(12):1432-1438.)，单独的cry2并不能在蓝光下发生聚集和相变，关键的因子是相变蛋白的idr，只有在idr存在的情况下，cry2才能发挥其协同作用，促进蛋白相变的发生。
4、相变蛋白的idr越小，越容易模块化，方便基因操作。作为相变蛋白的idr，之前的报道无论是fus(1-214aa)，ddx4(1-236aa)和hnrnpa1(186-320aa)，他们的蛋白内部无序区(idr)都比较大。
5、因此，需要寻找一个更小的、更有效的idr相变蛋白元件。
技术实现思路
1、本专利技术人找到了一个新的相变蛋白kctd17。kctd17相变能力很强，单独自身可以发生相变，形成液滴状结构，在与靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)偶联后还能够有效地让融合蛋白发生蛋白相变，形成固态的相变蛋白结构。为了让相变变得更加动态和可操控，专利技术人进一步地筛选到相变蛋白的内部无序区(idr)-kctd17 idr，它具有以下优点：只有54个氨基酸，比各种已知idr(fus：214aa；ddx4：236aa；hnrnpa1：135aa；)都更小、更有优势。进一步地，本专利技术人在pegfp-n1载体的基础上，引入了两个相变必需元件：kctd17 idr和cry2 phr，最终得到了一个简便的、时空调控蛋白相变的真核表达质粒系统-optodroplet-kctd17 idr。
2、本专利技术人将相变的真核表达质粒系统optodroplet-kctd17 idr和靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)的表达结合起来，专利技术了一种的新的蛋白表达体系，将靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)插入到optodroplet-kctd17 idr质粒中，和kctd17 idr，cry2元件偶联表达，转染细胞后，通过蓝光诱导促使optodroplet质粒表达的融合蛋白在细胞内部发生蛋白相变，形成液滴状结构，增加了靶蛋白的局部浓度。转染细胞经过pfa/甲醇固定操作后，这些液滴状结构的相变蛋白聚集体仍然能够稳定存在。因此，本专利技术将新改造的optodroplet-kctd17 idr和临床检测蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)表达质粒相结合，能够改变多种胞内蛋白的表达模式，形成液滴状结构。因此本专利技术将kctd17 idr、cry2元件和靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)组成了一个新的真核表达质粒系统optodroplet-kctd17 idr，可以使蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)发生聚集，增强其信号。在一些实施方式中，在共聚焦荧光显微镜上测量抗原蛋白的信号强度能提高十几倍。
3、因此，一方面，本专利技术提供了一种多肽，其包含氨基酸序列如seq id no:3所示的kctd17 idr。本专利技术的多肽可以用作相变蛋白元件与靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)形成融合蛋白。
4、另一方面，本专利技术提供了一种核酸分子，其包含编码上述多肽的多核苷酸。
5、在一些实施方式中，所述核酸分子包含如seq id no:4所示的多核苷酸。
6、另一方面，本专利技术提供了一种载体，其包含上述核酸分子。
7、在一些实施方式中，所述载体可以是表达载体。进一步地，在一些实施方式中，所述载体可以是原核表达载体或真核表达载体。
8、在一些实施方式中，所述载体可以是质粒。
9、在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含编码光诱导多聚化蛋白结构域的多核苷酸。所述光诱导多聚化蛋白结构域可以是指能够响应光刺激发生二聚甚至多聚的蛋白的结构域，其实例包括但不限于，cry2 phr，光敏色素b的nte结构域(n-terminalextension(nte))和向光色素1的lov2结构域(lov2 domain of phototropin 1)。
10、在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含编码荧光蛋白标签的多核苷酸。所述荧光蛋白标签可以是指能够自发产生荧光的蛋白，具有荧光标记和示踪的功能。其实例包括但不限于，mcherry，gfp，rfp，yfp，dsred等。
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【技术保护点】
1.一种多肽，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的KCTD17 IDR。
2.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸，优选地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
3.一种载体，其包含上述核酸分子。
4.根据权利要求3所述的载体，其中，所述载体是表达载体，优选地，所述载体是原核表达载体或真核表达载体，优选地，所述载体是质粒。
5.根据权利要求4所述的载体，其中，所述表达载体进一步地包含
6.根据权利要求4或5所述的载体，
7.根据权利要求4或5所述的载体，其中，所述表达载体进一步地包含靶蛋白基因，优选地，所述靶蛋白基因选自抗原蛋白基因，特别是自身免疫抗原蛋白基因，更优选地，所述靶蛋白基因选自Titin基因、GAD65基因、GFAP基因、MBP基因、Hu基因、Yo基因、Ri基因、CV2基因、Amphiphysin基因、Ma1基因、Ma2基因、SOX1基因、Zic4基因、Recoverin基因、PKCγ基因。
8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述靶蛋
9.根据权利要求4或5所述的载体，其中，所述表达载体通过包括以下步骤的方法得到：将KCTD17 IDR与荧光蛋白标签和光诱导多聚化蛋白结构域偶联，构建到pEGFP-N1质粒中，在KCTD17 IDR和荧光蛋白标签之前保留多克隆酶切位点，以插入靶蛋白基因。
10.一种细胞，其包含根据权利要求4-9中任一项所述的载体，优选地，所述细胞选自HEK293T细胞、Hela细胞、Hep2细胞。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽，其包含氨基酸序列如seq id no:3所示的kctd17 idr。
2.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸，优选地，所述核酸分子包含如seq id no:4所示的多核苷酸。
3.一种载体，其包含上述核酸分子。
4.根据权利要求3所述的载体，其中，所述载体是表达载体，优选地，所述载体是原核表达载体或真核表达载体，优选地，所述载体是质粒。
5.根据权利要求4所述的载体，其中，所述表达载体进一步地包含
6.根据权利要求4或5所述的载体，
7.根据权利要求4或5所述的载体，其中，所述表达载体进一步地包含靶蛋白基因，优选地，所述靶蛋白基因选自抗原蛋白基因，特别是自身免疫抗原蛋白基因，更优选地，所述靶蛋白基因选自t...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝峻巍，刘亮，文欣玫，徐芳，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：
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