【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学，具体涉及一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
1、帕金森病（parkinson’s disease, pd）是全球第二大发病率的神经退行性疾病，具有庞大的发病人群。pd的发病病理是中脑黑质多巴胺能细胞的减少。因此，利用干细胞的替代治疗pd是目前研究治疗方案的重点。
2、在神经系统干细胞领域内，干细胞向多巴胺能（dopamine，da）神经元分化能力、分化效率、体内存活率、临床安全性、供体组织的可用性和伦理问题等一直是研究者们关心的重点。研究者们已经研究出各种不同类型的细胞，如胎脑细胞、胚胎干细胞（esc）、诱导多能干细胞（ipsc）、间充质干细胞（msc）等。其中esc、ipsc是目前神经系统应用最广泛的干细胞。他们可以分化为多种细胞类型，其中包括多巴胺能神经元前体细胞（dap），为应用于帕金森病的干细胞治疗提供了基础。但esc、ipsc的应用可能会增加肿瘤发生的风险。
3、近日来，诱导神经干细胞来源的多巴胺能前体细胞（induced neural stem cell-derived dopaminergic precursors cells, insc-daps）在离体和动物在体实验中表现出良好的治疗效果，同时其具有低免疫原性和低致瘤性的特点。然而，由于引入外来细胞，细胞替代治疗pd仍存在不可控性，存在移植物诱导异动症的副作用。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种受调控的多巴胺能神经细胞及其制备方法
2、为此，第一方面，本专利技术提供一种受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，包括对诱导神经干细胞（inscs）进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hm3dq或抑制性受体hm4di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。
3、通过本专利技术提供的方法可制备得到受氯氮平-n-氧化物（cno）调控的多巴胺能神经细胞。在体外和体内均验证了其细胞功能可受cno调控，具有良好的临床应用前景。
4、在一些实施方式中，所述标志物包括foxa2、nurr1、th、tuj1中的至少一种。例如，所述标志物为foxa2、nurr1中的至少一种。
5、上述标志物中，foxa2是底板区域多巴胺能前体细胞（dopaminergic precursorcells，dap）特异性蛋白，可提示细胞向中脑a9区域da神经元分化。nurr1是中脑a9区域成熟da神经元的表面标志物。th、tuj1是成熟da神经元的分子标志物，在a9区域和a10区域成熟da神经元内均有表达。
6、在一些实施方式中，所述分化培养的步骤包括：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
7、第一阶段培养，在分化培养的前10天，应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有sag1和fgf8；
8、第二阶段培养，在第一阶段培养之后，应用第二阶段培养基进行培养；所述第二阶段培养基含有camp、dapt、ascorbic acid、bdnf、gdnf、tgf-b3。
9、在一些实施方式中，所述第二阶段培养的时间为3-26天。
10、在一些实施方式中，所述第一阶段培养基的包括：dmem/f12，胰岛素（insulin），n2添加剂，b27添加剂，glutamax，enaa，sag1，fgf8。
11、在一些实施方式中，所述第二阶段培养基包括：dmem/f12，胰岛素（insulin），n2添加剂，b27添加剂，glutamax，enaa，camp，dapt，抗坏血酸（ascorbic acid），bdnf，gdnf，tgf-b3。
12、在一些实施方式中，所述基因编辑的方法包括：采用crispr/cas9技术向诱导神经干细胞的aavs1位点敲入表达兴奋性受体hm3dq或抑制性受体hm4di。
13、在一些实施方式中，所述基因编辑的方法包括：向所述诱导神经干细胞转染表达cas9、靶向aavs1位点的grna的质粒，兴奋性受体hm3dq或抑制性受体hm4di的供体质粒。
14、在一些实施方式中，所述grna的序列为seq id no：1。
15、在一些实施方式中，所述表达cas9、靶向aavs1位点的grna的质粒的构建方法包括：将所述grna的对应dna序列可操作性地连接至px458质粒中。
16、在一些实施方式中，所述抑制性受体hm4di的供体质粒的构建方法包括：将aavs1-pur-cag-hm4di-mcherry质粒的mcherry切割，并且在hm4di的下游插入t2a-zsgreen片段，使hm4di与t2a-zsgreen片段由t2a序列连接，即所述抑制性受体hm4di的供体质粒。
17、在一些实施方式中，所述兴奋性受体hm3dq的供体质粒的构建方法包括：将aavs1-pur-cag-hm3dq-mcherry质粒的mcherry切割，并且在hm3dq的下游插入t2a-zsgreen片段，使hm3dq与t2a-zsgreen片段由t2a序列连接，即所述兴奋性受体hm3dq的供体质粒。
18、本专利技术的第二方面，提供一种受调控的多巴胺能神经细胞，其通过本专利技术第一方面所述的制备方法制备得到。
19、在一些实施方式中，所述多巴胺能神经细胞为多巴胺能前体细胞（dap）、多巴胺能（da）神经元中的至少一种。
20、通过分化培养，使得编辑后的诱导神经干细胞向多巴胺能神经元方向分化；在此过程中，编辑后的诱导神经干细胞依次分化为多巴胺能前体细胞和多巴胺能神经元。通过foxa2标志物阳性，可表征分化得到多巴胺能前体细胞；当nurr1、th或tuj1标志物阳性时，可表征分化得到多巴胺能神经元。在一些实施例中，按照本专利技术提供的分化培养步骤，由所述第一阶段培养10天以及第二阶段培养0~8天可获得多巴胺能前体细胞；由所述第一阶段培养以及第二阶段培养20天以上，可获得多巴胺能神经元。
21、在一些实施方式中，所述多巴胺能神经元为a9区多巴胺能神经元。通过nurr1标志物阳性，可表征a9区多巴胺能神经元。
22、在一些实施方式中，所述受调控的多巴胺能神经细胞包括第一阶段细胞和第二阶段细胞；
23、所述第一阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的诱导神经干细胞进行第一阶段培养；所述第一阶段培养包括应用第一阶段培养基进行培养；所述第一阶段培养基含有sag1和fgf8；所述第一阶段培养的时间为10天；
24、所述第二阶段细胞通过以下方法制备得到：对所述编辑后的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，包括对诱导神经干细胞进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。
2.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述标志物包括FoxA2、NURR1、TH、Tuj1中的至少一种。
3.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述分化培养的步骤包括：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
4.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述基因编辑的方法包括：采用CRISPR/Cas9技术向所述诱导神经干细胞的AAVS1位点敲入表达兴奋性受体hM3Dq或抑制性受体hM4Di；
5.如权利要求4所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述抑制性受体hM4Di的供体质粒的构建方法包括：将AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCh
6.一种受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，通过权利要求1-5中任一项所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法制备得到。
7.如权利要求6所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述受调控的多巴胺能神经细胞为多巴胺能前体细胞、多巴胺能神经元中的至少一种。
8.如权利要求7所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述多巴胺能神经元为A9区多巴胺能神经元。
9.如权利要求6所述的受调控的多巴胺能神经细胞，其特征在于，所述受调控的多巴胺能神经细胞包括第一阶段细胞和第二阶段细胞；
10.权利要求6-9中任一项所述的受调控的多巴胺能神经细胞在制备治疗帕金森病药物方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，包括对诱导神经干细胞进行基因编辑，使其表达兴奋性受体hm3dq或抑制性受体hm4di，得到编辑后的诱导神经干细胞；对所述编辑后的诱导神经干细胞进行分化培养，使其表达多巴胺能神经细胞的标志物，即制备得到受调控的多巴胺能神经细胞。
2.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述标志物包括foxa2、nurr1、th、tuj1中的至少一种。
3.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述分化培养的步骤包括：对所述编辑后的诱导神经干细胞依次进行以下培养：
4.如权利要求1所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述基因编辑的方法包括：采用crispr/cas9技术向所述诱导神经干细胞的aavs1位点敲入表达兴奋性受体hm3dq或抑制性受体hm4di；
5.如权利要求4所述的受调控的多巴胺能神经细胞的制备方法，其特征在于，所述抑制性受体hm...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈志国，韩德强，王雪瑶，
申请(专利权)人：首都医科大学宣武医院，
类型：发明
国别省市：
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