【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物遗传转化，特别是涉及一种菊、艾和白前“无需组织培养”的毛状根遗传转化方法。
技术介绍
1、本部分的陈述仅仅是提供了与本专利技术相关的
技术介绍
信息，不必然构成在先技术。
2、菊、艾和白前为湖北省道地药材，这三种材料遗传转化体系作为分子精准育种和基因功能研究的必需技术，亟待进行建立。目前对于菊、艾和白前的研究多局限于有效成分方面，遗传转化技术研究暂为空白。传统遗传转化方式都是在严格无菌环境下利用农杆菌侵染植株，利用植物组织培养技术，通过外植体的脱分化和再分化实现基因的转化，一般要经过以下几个过程，包括材料选择、预培养、共培养、筛选培养和植株再生。该过程要求严格无菌的实验条件、熟练准确的操作技能、且存在转化效率低、转化周期长等问题。如棉花通过组培方式获得阳性幼苗需要4-6个月，诱导效率1％；水稻通过组培方式获得阳性幼苗需要48-65天，诱导效率5.0％-7.5％。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种快速获得药材转基因毛状根的“无需组织培养”的遗传转化方法，本专利技术使用无需组培的遗传转化方式可以从大田里收取枝条作为受体材料，利用发根农杆菌进行侵染，并在开放条件下扦插在蛭石中培养，进而获得菊、艾和白前的转基因毛状根。可实现在菊、艾和白前等植物中表达目的产物，如次生代谢物绿原酸、矢车菊素以及皂苷类成分，实现目的产物的大量、快速生产。为实现上述目的，本专利技术的一个或多个实施例提供了如下技术方案：
2、本专利技术提供了一种菊
3、本专利技术还提供了一种菊、艾和白前的遗传转化方法，包括以下步骤：
4、步骤1，将待转的基因转入发根农杆菌的感受态细胞中，经活化培养后，挑取阳性菌株经培养后提取菌体，利用培养基重悬所述菌体至od值为0.6-1.0，于黑暗条件下放置，得菌悬液；黑暗条件下放置时间1-3h；
5、步骤2，将外植体完全浸入所述菌悬液中真空浸润20-30min，所述外植体选自菊、艾或白前的枝条底部或叶片；
6、步骤3，共培养：转基因毛状根的诱导，将浸润后的植物材料扦插于育苗盘中，确保植物材料的枝条基部、叶柄基部或叶片切口处伤口被育苗盘内基质覆盖，其余部分露出空气中；育苗盘保持基质湿润不积水，移至人工气候室内培养30-60天，生成毛细根。
7、步骤1中，培养基选用mgl培养基，配制方法为，每升水加入胰蛋白胨5g，氯化钠5g，七水合硫酸镁0.1g，磷酸二氢钾0.25g，甘露醇5g，甘氨酸1.0g，调节ph＝5.8。
8、在本专利技术的具体实施方式中，作为侵染液的菌悬液中农杆菌od600＝0.4-0.8。
9、优选的，所述外植体的获得方法为：取新发幼嫩枝条或将组培培养的成苗缓苗后选取幼嫩枝条部分。优选的，外植体取取当年新萌发15-20d幼嫩枝条。在本专利技术的实施例中，选取生命力旺盛的、当年生新发枝条。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述白前包括柳叶白前或芫花叶白前。
11、在本专利技术的具体实施方式中，所述发根农杆菌选自k599、msu440或ar.a4之一；优选msu440或ar.a4；
12、或，所述发根农杆菌中包括目的质粒。
13、在本专利技术的具体实施方式中，所述目的质粒包括功能基因；所述功能基因包括具有药用价值的基因或标记基因；
14、进一步，所述具有药用价值的基因包括萜类合成基因如cmtps1,2,3、黄酮合成基因如ntmyb27、皂苷类合成基因如cyp90g4/cyp94d108；所述标记基因包括ruby系统、氯霉素乙酰转移酶基因cat、荧光素酶基因luc、β-葡萄糖苷酸酶基因gus、分泌型碱性磷酸酶基因seap、绿色荧光蛋白基因gfp。
15、本专利技术中，所述药用价值尤其指次生代谢物，如黄酮、萜类、酚酸、多糖以及皂苷类成分；如绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、龙脑、β-蒎烯、α-蒎烯、异泽兰黄素、野黄芩素、白前新皂苷a、b以及多糖等。
16、本专利技术的具体实施方式中，目的质粒为35s::ruby，即目的基因为ruby，addgene号:160908。
17、在本专利技术的具体实施方式中，步骤2中，所述外植体植物材料与菌液侵染共培养的条件为：枝条底部静置浸泡在菌液下20～30min，温度为25-30℃。
18、作为优选，所述人工气候室内环境具体是光周期16h光照/8h黑暗，温度保持在22℃-26℃，湿度保持在70％～90％。
19、作为优选，所述育苗盘内基质采用灭菌纯蛭石。培养时育苗盘采用清水浇灌。
20、同时携带ruby报告基因和目的基因的发根农杆菌中的发根农杆菌采用msu440或ar.a4，具体制备过程如下：将携带ruby报告基因-目的基因的msu440或ar.a4农杆菌菌株接种至含有50mg/l潮霉素的ty固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天；分别挑取若干单菌落接种至含有50mg/l潮霉素的ty液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12h；随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液od600＝1.0～1.2，5000rpm离心10min后收集菌液，弃上清，加入mgl缓冲液重悬，调节od600＝0.8，黑暗28℃静置1h备用。
21、所述ty培养基成分为：每升水加入并溶解胰蛋白胨5g，酵母浸出物3g，每升水加入无菌的1m氯化钙水溶液，ty固体培养基为每升ty液体培养基加入15g琼脂粉。
22、mgl缓冲液成分为：每升水加入市场上购买的胰蛋白胨5g，氯化钠5g，七水合硫酸镁0.1g，磷酸二氢钾0.25g，甘露醇5g，甘氨酸1.0g，调节ph＝5.8。
23、本专利技术的另一个目的是提供一种菊、艾和白前转基因植物，通过所述的方法构建而成。
24、本专利技术的有益效果是：
25、1，本专利技术提供的毛状根遗传转化方法只需要6-8周即可获得大量转基因发根，在菊、艾和白前的枝条和叶片中均可成功转化，克服了现有技术转化效率低、转化周期长的问题。
26、2，本专利技术方法操作简单，一步法免组培方式大大减少了组培的繁琐流程；采用枝条作为植物材料不受时间限制，不受品种限制；纯蛭石培养基、清水浇灌，具备操作简单、成本低、通量高、周期短等优点；此外，利用ruby标记可视化基因产生的甜菜红素，可实现转化子的批量、快速、低成本无损检测。
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1.一种菊、艾和白前“无需组织培养”的毛状根遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，外植体的获得方法为：取新发幼嫩枝条或将组培培养的成苗缓苗后选取幼嫩枝条部分。
3.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，外植体取当年新萌发15-20d幼嫩枝条。
4.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，所述白前包括柳叶白前或芫花叶白前。
5.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，作为侵染液的菌悬液中农杆菌OD600＝0.4-0.8。
6.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌选自K599、MSU440或Ar.A4之一；优选MSU440或Ar.A4；
7.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，共培养步骤中，人工气候室内环境具体是光周期16h光照/8h黑暗，温度保持在22℃-26℃，湿度保持在70％～90％。
8.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，所述育苗盘内
9.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，同时携带RUBY报告基因和目的基因的发根农杆菌中的发根农杆菌采用MSU440或Ar.A4，制备过程如下：将携带RUBY报告基因-目的基因的MSU440或Ar.A4农杆菌菌株接种至含有50mg/L潮霉素的TY固体培养基中划线培养，28℃恒温培养箱活化培养2天；分别挑取若干单菌落接种至含有50mg/L潮霉素的TY液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养12h；随后将菌液按1:100的比例扩大培养至菌液OD600＝1.0～1.2，5000rpm离心10min后收集菌液，弃上清，加入MGL缓冲液重悬，调节OD600＝0.8，黑暗28℃静置1h备用；
10.一种菊、艾和白前转基因植物，其特征在于，通过权利要求1～9任一项所述的方法构建而成。
...【技术特征摘要】
1.一种菊、艾和白前“无需组织培养”的毛状根遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，外植体的获得方法为：取新发幼嫩枝条或将组培培养的成苗缓苗后选取幼嫩枝条部分。
3.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，外植体取当年新萌发15-20d幼嫩枝条。
4.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，所述白前包括柳叶白前或芫花叶白前。
5.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，作为侵染液的菌悬液中农杆菌od600＝0.4-0.8。
6.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌选自k599、msu440或ar.a4之一；优选msu440或ar.a4；
7.根据权利要求1所述的毛状根遗传转化方法，其特征在于，共培养步骤中，人工气候室内环境具体是光周期16h光照/8h黑暗，温度保持在22℃-26...
【专利技术属性】
技术研发人员：苗玉焕，张婧怡，刘大会，彭赛男，刘方杰，
申请(专利权)人：湖北中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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