一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种C
‑
scFv
‑
Nluc双功能融合蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，涉及一种双功能融合蛋白，特别涉及一种
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白，本专利技术还涉及
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白的应用
。

技术介绍

[0002]皮质醇是人类主要的糖皮质激素，在调节各种生理过程中发挥着重要作用，如碳水化合物代谢
、
应激反应和炎症反应等
。
许多研究报告称，皮质醇昼夜节律受到个体的食物消耗
、
活动和心理
/
情绪压力的影响
。
在血液中，正常皮质醇水平在早上高
(50
～
230ng/mL)、
在晚上低
(30
～
160ng/mL)。
皮质醇水平升高会导致免疫系统抑郁，并增加血液中的脂肪酸和氨基酸浓度，这可能会导致库欣综合征
(Cushing
’
s syndrome)
的发生，症状包括高血压
、
肥胖和抑郁
。
另一方面，爱迪森氏病
(Addison
’
s disease)
的皮质醇水平低会导致头晕
、
疲劳
、
体重减轻
、
皮肤褶皱和疤痕变暗等
。
因此，皮质醇的测量对于监测压力相关疾病至关重要，并有助于诊断皮质醇水平异常引起的疾病
。
[0003]相较于耗时
、
费力
、
需要专业技术人员操作的高效液相
(HPLC)、
液相色谱
(LC)
等仪器分析方法，基于免疫学原理的免疫分析方法，如酶联免疫吸附测定
(ELISA)
，具有简单
、
快速
、
可高通量筛选等突出优点，已广泛医学诊断
、
环境和食品分析等领域
。
但传统
ELISA
需要酶标二抗
、
较多的洗涤步骤，且基于辣根过氧化物酶
(HRP)
催化的显色反应存在着灵敏度较低等瓶颈问题，严重妨碍了其更广泛
、
更灵敏度的应用
。
[0004]单链抗体
(scFv)
是免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合蛋白，通过柔性多肽进行连接，保留和维持了抗体的功能性与特异性；纳米荧光素酶分子量小
、
不需要
ATP、
发光效率高
、
在各个
PH、
温度下理化性质均比较稳定等优点；通过单链抗体
‑
纳米荧光素酶双功能融合蛋白，可明显地提高检测灵敏度
、
缩短反应时间
、
以及减少洗涤步骤等，极大提高免疫分析的应用潜能
。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的缺点和不足之处，本专利技术的目的在于提供一种
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白，该双功能融合蛋白具有特异识别作用和信号放大作用
。
[0006]本专利技术另一目的在于提供上述
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白用于检测尿液中皮质醇含量的应用
。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供技术方案是这样的：
[0008]一种
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白，所述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白通过下述方法制备的：
[0009]以抗皮质醇单链抗体
(C
‑
scFv)
作为生物识别物质，以纳米荧光素酶
(Nluc)
作为生物发光催化剂，扩增
C
‑
scFv
与
Nluc
的基因，构建表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
，导入大肠杆菌感受态
BL21(DE3)/pLysS
中进行表达
、
纯化所获得的
。
[0010]进一步的，上述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白，所述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合蛋白通
过下述方法制备的：
[0011](1)C
‑
scFv
‑
Nluc
表达载体的构建：基于特异性引物，通过
PCR
技术，分别扩增皮质醇特异性
scFv
和
Nluc
的基因；利用重叠
PCR
技术，扩增得到
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合基因；经过核酸内切酶双酶切
、
切胶回收基因产物
、T4
连接酶连接，获得表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
；
[0012](2)C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白制备：通过水热法，将表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
转化至感受态细胞
BL21(DE3)/pLysS
中，挑选阳性单克隆细菌，验证后进行诱表达双功能融合蛋白；
[0013]进一步的，上述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白，步骤
(1)
所述
C
‑
scFv
‑
Nluc
表达载体的构建具体按照以下步骤：
[0014]分别以
SNF1
和
SNR1
以及
SNF2
和
SNR2
为引物，分别克隆
C
‑
scFv
以及
Nluc
基因；
[0015]分别以第一轮扩增所得的
C
‑
scFv
以及
Nluc
基因产物为模板，以
SNF1
和...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种双功能
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合蛋白，其特征在于，所述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白通过下述方法制备的：以抗皮质醇单链抗体
(C
‑
scFv)
作为生物识别物质，以纳米荧光素酶
(Nluc)
作为生物发光催化剂，扩增
C
‑
scFv
与
Nluc
的基因，构建表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
，导入大肠杆菌感受态
BL21(DE3)/pLysS
中进行表达
、
纯化所获得的
。2.
根据权利要求1所述的双功能
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合蛋白，其特征在于，所述的
C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白通过下述方法制备的：
(1)C
‑
scFv
‑
Nluc
表达载体的构建：通过
PCR
技术，分别扩增
C
‑
scFv
以及
Nluc
基因；然后利用
overlap PCR
方式，拼接得到
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合基因；再经过限制性核酸内切酶酶切
、
切胶回收基因产物
、T4
连接酶连接，构建表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
；
(2)C
‑
scFv
‑
Nluc
双功能融合蛋白制备：通过热击法，将表达载体
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
转化到感受态细胞大肠杆菌
BL21(DE3)/pLysS
中，挑选阳性单克隆细菌，经基因测序验证后，进行诱导双功能融合蛋白的表达，并纯化
。3.
根据权利要求1所述的双功能
C
‑
scFv
‑
Nluc
融合蛋白，其特征在于，步骤
(1)
所述
pET22b(+)
‑
C
‑
scFv
‑
Nluc
表达载体的构建具体按照以下步骤：分别以
SNF1
和
SNR1
以及
SNF2
和
SNR2
为引物，分别克隆
C
‑
scFv
以及
Nluc
基因；以第一轮扩增所得
C
‑
scFv
以及
Nluc
基因为模板，以

【专利技术属性】
技术研发人员：崔锡平，何绮怡，杨慧怡，林明霞，苏静怡，赵肃清，穆云萍，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：