人尿液来源的诱导的体节前中胚层祖细胞及其用途制造技术

本文提供了一种从尿液细胞中重编程或诱导体节前中胚层祖细胞的方法

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人尿液来源的诱导的体节前中胚层祖细胞及其用途


[0001]本申请涉及人尿液来源的尿液细胞诱导的体节前中胚层祖细胞
(UiPSM)、
由
UiPSM
细胞形成的类体节结构
、
产生
UiPSM
细胞和类体节结构的方法及其用途
。

技术介绍

[0002]终末分化的体细胞可以成功地重新编程为多能干细胞，拓宽了成体细胞重新编程为干细胞的研究领域
(Takahashi
等人
,2007
；
Takahashi
和
Yamanaka,2006)。
此外，诱导多能干细胞
(iPSC)
具有向胚层分化的潜力，但其致瘤性的风险限制了其应用，而致瘤性归因于
iPSC
诱导分化的细胞，效率不能达到
100
％
。
其次，对人体细胞而言，成纤维细胞
、
血细胞
、
羊膜细胞
、
皮肤上皮干细胞
、
近端小管
(HK2)
细胞系
、
周细胞来源细胞
、
内皮细胞
、
胰腺外分泌细胞等多种细胞都是重编程诱导起始的来源，而这些细胞的获取会对受试者造成一定程度的损伤
。
[0003]此外，非侵入性获得的尿液细胞可以被重新编程为诱导多能干细胞
(iPSC)
和神经祖细胞
(NPC)(Wang
等人，
Generation of integration
‑
free neural progenitor cells from cells in human urine
，
Nat Methods 10
，
84
‑
89
，
2013
；
Zhou
等人，
Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples
，
Nat
‑
Protoc 7
，
2080
‑
2089
，
2012)
，提示尿液细胞作为一种起始细胞具有很强的可塑性，可作为诱导分化的起始细胞，在临床应用中具有一定的优势
。
[0004]脊椎动物胚胎表现出高度保守的组织空间格局特征
。
双命运神经中胚层祖细胞
(NMP)
最令人信服的证据来自具有自我更新能力的尾芽细胞群，这些细胞将迁移至神经管和预定体节中胚层位置进行发育
(Henrique
等人，
2015)。
体节前中胚层细胞
(PSM)
是一种来源于尾侧外胚层
(CLE)
的轴向干细胞，可以沿着前后轴形成体节，这决定了胚胎发育过程中体轴的延伸
(Henrique
等人，
2015
；
Saito
和
Suzuki,2020)。
轴旁中胚层
(
又称体节中胚层
)
细胞可发育为骨骼谱系
、
肌细胞谱系和真皮细胞谱系，并进一步分化为肌肉骨骼系统，但由于伦理和技术的限制，在人胚胎中很难获得自我更新的
PSM
细胞
。
因此，体外构建自我更新的
PSM
祖细胞对躯体发生的研究具有重要意义
。
然而，由于伦理和技术的限制，很难在人胚胎中获得自我更新的
PSM
细胞
。
[0005]尽管人类胚胎干细胞
(ES)
可以分化为
PSM
，并在确定的条件培养基中聚集后生成三维“原肠胚”模型
(Beccari
等人，
2018
；
Moris
等人，
2020)
，原肠胚形成的发生使其不能很好的模仿体节发生过程，因此不是研究相关疾病的好模型
。
该结果主要归因于主动聚集的细胞缺乏
PSM
特性，如体节中胚层细胞的自我更新和多潜能分化
。
因此，产生自我更新的
PSM
细胞以构建类体节结构来模拟胚胎早期发育中的体节发生是至关重要的
。
[0006]专利技术概述
[0007]本公开表明，尿液细胞可以被重新编程为体节前中胚层祖细胞，其能稳定扩增并分化为中胚层谱系细胞
。
体节前中胚层祖细胞还能够自组装形成类体节结构，以模拟体节发生
。
[0008]所产生的体节前中胚层祖细胞在本文中被指定为尿液来源尿液细胞诱导的体节前中胚层祖细胞
(
缩写为
UiPSM)。UiPSM
细胞高表达体节前中胚层相关基因，具有体节前中胚层转录特征表达谱
。
重要的是，
UiPSM
细胞退出多能状态，降低了肿瘤形成的风险，同时保留了分化为体节前中胚层谱系细胞的潜力
。
[0009]UiPSM
细胞可以在体外自组装以产生类体节
(UiSomitoid)
结构，这是一种
UiPSM
自组装的类似于体节的“喙尾”结构
。UiSomitoid
结构模仿了胚胎早期发育过程中体节形成中类似组织的建立，主要涉及基于干细胞的胚胎模型
(SCME)
研究方向
。UiSomitoid
结构可以更好地模拟胚胎体节发生的前后轴和分子钟的建立
。
[0010]在一个方面，本文提供了一种诱导尿液细胞以获得体节前中胚层祖细胞
(UiPSM
细胞
)
的方法
。
具体地，该方法可以包括以下步骤：
[0011](a)
培养尿液细胞并从培养的尿液细胞中选择上皮样细胞；
[0012](b)
用载体转化上皮样细胞；
[0013](c)
在补充有
WNT
激动剂
、DOT1L
抑制剂和生长因子
(
一种或多种
)
的基础培养基中诱导经转化的上皮样细胞
。
[0014]在一些实施方案中，从自一个或多个受试者收集的上尿路尿液样品中获得所述尿液细胞
。
[0015]在一些实施方案中，将尿液细胞用
REGM
培养基培养，并且在培养过程中主要富集上皮样细胞和间充质细胞类型
。
[0016]在一些实施方案中，所述上皮样细胞通过用一种或多种载体电穿孔进行转化，以使细胞易感于随后的诱导
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种诱导尿液细胞以生成体节前中胚层祖细胞的方法，其包括以下步骤：
(a)
将活的尿液细胞培养一段合适的时间以出现上皮样细胞，并分离所述上皮样细胞；
(b)
在补充有
WNT
激动剂
、DOT1L
抑制剂和一种或多种生长因子的基础培养基中诱导所述上皮样细胞足够长的时间以形成颗粒状集落；和
(c)
从所述集落中获得体节前中胚层祖细胞
。2.
权利要求1的方法，其中在步骤
(b)
之前，用一种或多种载体预处理所述上皮样细胞，所述载体能够改善细胞的通透性用于诱导或增强细胞重编程
。3.
权利要求2的方法，其中所述载体表达一种或多种以下因子：
Oct4、Sox2、SV40LT、Klf4、miRNA 302、miRNA 303、miRNA 304、miRNA 305、miRNA 306
和
miRNA 307。4.
根据权利要求2或3的方法，其中在所述预处理之后，进一步培养所述上皮样细胞以恢复其能力
。5.
前述权利要求中任一项的方法，其中从上尿路尿液样品中分离所述尿液细胞，所述上尿路尿液样品是从一个或多个供体受试者收集的
。6.
前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤
(a)
中，将尿液细胞在
REGM
培养基中培养
。7.
前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤
(b)
中，所述基础培养基是
DMEM、DMEM/F12
或
Advanced DMEM/F2。8.
前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长因子选自
FGF(
例如
bFGF)、EGF、VEGF、PDGF、TGF
‑
β
、PD
‑
ECGF、TNF、HGF、IGF(
例如
IGF1)、BMP、
红细胞生成素
、CSF、M
‑
CSF
及其片段或变体
。9.
前述权利要求中任一项的方法，其中所述生长因子是
bFGF
和
EGF。10.
前述权利要求中任一项的方法，其中所述
WNT
激动剂是
CHIR99021
，和
/
或所述
DOT1L
抑制剂是
EPZ5676。11.
权利要求
10
的方法，其中所述基础培养基为
Advanced DMEM/F12
，其补充有浓度范围为2‑4μ
M(
例如3μ
M)
的
CHIR99021、
浓度范围为4‑6μ
M(
例如5μ
M)
的
EPZ5676、
浓度范围为4‑
6ng/
μ
l(
例如
5ng/
μ
l)
的
bFGF
和浓度范围为4‑
6ng/
μ
l(
例如
5ng/
μ
l)
的
EGF。12.
前述权利要求中任一项的方法，其中步骤
(b)
中的诱导进行7‑
12
天，例如9‑
10
天
。13.
通过前述权利要求中任一项的方法获得或能获得的体节前中胚层祖细胞
。14.
一种用于培养权利要求
13
的体节前中胚层祖细胞的方法，其包括在补充有
WNT
激动剂
、TGF
‑
β
抑制剂和一种或多种生长因子的基础培养基中培养所述体节前中胚层祖细胞
。15.
权利要求
14
的方法，其中所述基础培养基是
DMEM、DMEM/F12
或
Advanced DMEM/F2。16.
权利要求
14
或
15
的方法，其中所述
WNT
激动剂是
CHIR99021
，和
/
或所述
TGF
‑
β
抑制剂是
A8301。17.
权利要求
14
‑
16
中任一项的方法，其中所述生长因子选自
FGF(
例如
bFGF)、EGF、VEGF、PDGF、TGF
‑
β
、PD
‑
ECGF、TNF、HGF、IGF(
例如
IGF1)、BMP、
红细胞生成素
、CSF、M
‑
CSF
及其片段或变体
。18.
权利要求
17
的方法，其中所选择的生长因子是
bFGF
和
EGF。19.
权利要求
18
的方法，其中限定的培养基是
Advanced DMEM/F12
，其补充有浓度范围为2‑4μ
M(
例如3μ
M)
的
CHIR99021、
浓度范围为4‑6μ
M(
如5μ
M)
的
A8301、
浓度范围为4‑
6ng/
μ
l
(
例如
5ng/
μ
l)
的
bFGF
和浓度范围为4‑
6ng/
μ
l(
例如
5ng/
μ
l)
的
EGF。20.
权利要求
14
‑
19
中任一项的方法，其进一步包括将培养的体节前中胚层祖细胞传代
。21.
通过权利要求
14
‑
20
中任一项的方法获得或能获得的体节前中胚层祖细胞
。22.
一种用于将体节前中胚层祖细胞分化为骨骼肌细胞的方法，其包括：
(a)
将所述体节前中胚层祖细胞在补充有
WNT
激动剂
、TGF
‑
β
抑制剂和一种或多种生长因子的基础培养基中接种过夜；
(b)
在补充有
KSR、ITS、NEAA、
β
‑
ME、IGF
‑
1、HGF、CHIR99021、VC、Dex
和
SB431542
的基础培养基中诱导所述细胞；和
(c)
在补充有
KSR、
马血清
、NEAA、
β
‑
ME、IGF
‑1和
HGF
的基础培养基中诱导所述细胞
。23.
权利要求
22
的方法，其中在步骤
(b)
中，所述基础培养基补充有
15
％
KSR、1
％
ITS、1
％
NEAA、0.1
μ
M
β
‑
ME、4ng/ml IGF
‑
1、10ng/ml HGF、3
μ
MCHIR99021、50ng/ml VC、0.5ng/ml Dex
和
2nM SB431542。24.
权利要求
22
或
23
的方法，其中在步骤
(c)
中，所述基础培养基补充有
15
％
KSR、2
％马血清
、1
％
NEAA、0.1
μ
M
β
‑
ME、4ng/ml IGF
‑1和
10ng/ml HGF。25.
权利要求
22
‑
24
中任一项的方法，其中在步骤
(b)
中，所述诱导进行
12
‑
18
天范围内的时间段，例如
15
天
。26.
权利要求
22
‑
25
中任一项的方法，其中在步骤
(c)
中，进行所述诱导直到骨骼肌纤维束完全存在
。27.
一种用于将体节前中胚层祖细胞分化为成骨细胞的方法，其包括：
(a)
将所述体节前中胚层祖细胞在补充有...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴端卿，秦月，黄星南，曹尚涛，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：