一种基于单细胞全基因组扩增的制造技术

本发明专利技术公开了一种基于单细胞全基因组扩增的

【技术实现步骤摘要】
一种基于单细胞全基因组扩增的PKD1变异分子检测方法和应用


[0001]本专利技术属于胚胎植入前遗传检测领域，具体涉及一种基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法和应用
。

技术介绍

[0002]在二代测序的技术中，针对有其他高度同源区域的基因如
PKD1
等基因往往无法明确变异本身所在的位置是否在目标的基因区域或是在非目标的同源区
/
假基因区域
。
虽然这些基因上有一些
SNP
的存在，可能可以通过参考基因序列来比对到各自的特定区域，但是由于二代测序会将基因组
DNA
随机打断片段，而导致被打断的片段在测序过程中可能会因特异性
SNP
的不均匀测序结果而导致后续的生信分析流程中因为原始数据中的频率过低无法明确区分目标变异的实际所在区间
。
[0003]以
PKD1
基因为例，该基因在
16
号染色体上，并有6个高度同源的假基因
(PKD1P1、PKD1P2、PKD1P3、PKD1P4、PKD1P5、PKD1P6)(
编码区同源性约为
97.49
％
‑
98.81
％
)
，在一般的二代测序结果出来后，需要采用长链聚合酶连锁反应
(Long
‑
range PCR)
的方法来扩增出
PKD1
包含低频人群变异位点后，才能针对此长片段聚合酶产物进行
Sanger
测序或二代测序的合并方法才可能明确这类变异的存在
。
[0004]在
2021
年，北京大学第三医院
[A comprehensive PGT
‑
M strategy for ADPKD patients with de novo PKD1mutations using affected embryo or gametes as proband.Wang,Y et.al.Journal of Assisted Reproduction and Genetics.03May 2021]及郑州大学附属第一医院
[Anovel monogenic preimplantation genetic testing strategy for sporadic polycystic kidney caused by de novo PKD1mutation RUNNING TITLE:A novel PGT
‑
M strategy for ADPKD.Shi,H.et.al.Clin Genet.2021Feb
；
99(2):250
‑
258]的团队利用少量胚胎细胞进行全基因组扩增后，通过
Long
‑
range PCR
方法进行
Sanger
测序，再结合二代测序
(NGS)
所提供的多态情况
(SNP)
来决定变异是否位于特定的单倍体后，作为执行单基因
/
单基因疾病的植入前基因检测
(PGT
‑
M)
的策略，以筛选出健康的胚胎植入宫内，使患者能生育出不携带
PKD1(
疑似
)
致病变异的子女
。
[0005]上述策略都需要采用
Long
‑
range PCR
结合
Sanger
测序的方法来进行胚胎是否携带
(
疑似
)
致病变异的判定，然而
PKD1
基因的结构相当复杂，且其基因序列中的
GC
含量高达
70
‑
80
％，因此增加
Long
‑
range PCR
的执行难度
。
另外，利用胚胎细胞来扩增其全基因组
DNA
无法确保每一个胚胎的扩增产物片段都能产生足长的
DNA
扩增片段作为后续
Long
‑
range PCR
的模版
(template)
，这是因为一般受精卵在体外形成后，仅能体外培养5‑6天
(
囊胚
)
，从囊胚滋养外胚层中活检3‑8个细胞用于遗传学检测，所以能用来提取基因组
DNA
的细胞数相当稀少，无法保证在裂解以及扩增的过程中出现基因组
DNA
的部分断裂情况，一旦基因组断裂的部分在致病位点附近，就可能无法在扩增的过程中获取适合
Long
‑
range PCR
长度或序
列区间的
template
，因而提高
Long
‑
range PCR
的失败率，无法采用原有的策略来解决患者生育健康子女的问题
。
[0006]上述郑州大学的文献中，提及其所使用的
39
个胚胎有2个胚胎的扩增产物无法成功取得
Long
‑
range PCR
产物，而在实际使用的过程中，胚胎的父亲也是通过
Long
‑
range
‑
PCR
合并
sanger
的方式进行分子诊断，但当同样的引物来操作胚胎细胞的基因组扩增产物时，
10
个胚胎的基因组扩增产物均无法获得
Long
‑
range PCR
产物，说明原有的方法可能有极高的失败概率，急需开发一种新的检测方法
。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的主要目的是提出一种基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法，利用单精子
、
胚胎或极体的基因组
DNA
扩增产物来验证
(
疑似
)
致病变异的存在与否及与该
(
疑似
)
致病变异连锁的单倍体型，无需采用失败率较高的
Long
‑
range PCR
方法也能获得健康的胚胎
。
[0008]本专利技术的另一目的是提出上述基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法在非诊断目的的分子生物学检测中的应用
。
[0009]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0010]本专利技术提供一种非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法，其基于受试者男方单精子或者夫妻双方体外受精后的生殖细胞或胚胎细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1
：提取受试者男方单精子或者夫妻双方体外受精后的生殖细胞或胚胎细胞作为待测细胞，进行全基因组
DNA
扩增，得到全基因组
DNA
扩增产物；
S2
：查找
PKD1
基因变异位点和其假基因位点信息并设计引物；
S3
：针对所述全基因组
DNA
扩增产物中长度为
150
‑
250bp
的短片段进行扩增并进行深度靶向二代测序区分
PKD1
和假基因的
reads
，获得
PKD1
变异位点信息；
S4
：采用全基因组
SNP
芯片或二代测序对所述全基因组
DNA
扩增产物进行检测，得到全基因组
SNP
信息，其包含
PKD1
基因和其上下游
2Mb
内的
SNP
信息，从而进行基因组拷贝数变异分析；
S5
：同时结合突变信息和
SNP
信息进行
SNP
基因型分型，然后进行家系单体型连锁分析，判断受试者夫妻双方体外受精后的胚胎是否携带家系中
PKD1
突变所在的单体型
。2.
根据权利要求1所述的非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法，其特征在于，步骤
S1
中，所述待测细胞为体外受精后培养的囊胚滋养层活检细胞3‑8个或者极体或者单精子
。3.
根据权利要求1所述的非诊断目的的基于单细胞全基因组扩增的
PKD1
变异分子检测方法，其特征在于，步骤
S2
中，所述
PKD1
基因为人类可特异扩增
PKD1
基因，所述引物包括上
、
下游序列分别如
SEQ ID NO:1—30
所示的引物对
。4.
根...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，雷彩霞，奚燕萍，孙晓溪，
申请(专利权)人：上海集爱遗传与不育诊疗中心有限公司，
类型：发明
国别省市：