一种基于制造技术

本发明专利技术公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于Crispr/Cas12a系统检测入侵物种的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒及其应用
。

技术介绍

[0002]生物入侵是指生物由原生存地经自然的或人为的途径侵入到另一个新的环境，对入侵地的生物多样性
、
农林牧渔业生产以及人类健康造成经济损失或生态灾难的过程
。
对于特定的生态系统与栖息环境来说，任何非本地的物种都称为外来物种
。
生物入侵是当今世界最为棘手的三大环境难题之一
。
联合国大会于
2000
年
12
月
20
日宣布每年的5月
22
日为“生物多样性国际日”，以增加对生物多样性问题的理解和认识
。
[0003]据统计，入侵我国的有害杂草约
96
种，引起较大经济损失的入侵有害昆虫
、
植物病害
、
软体动物
、
哺乳动物等大约
80
种以上，如松材线虫
(Bursaphelenchus xylophilus)、
福寿螺
(Pomacea canaliculata)、
空心莲子草
(Alternanthera philoxeroides
，又名水花生
)、
鳄雀鳝
(Atractosteus spatula)、
埃及塘虱
(Clarias gariepinus)、
淡水石斑
(Parachromis managuensis
，又名马拉瓜丽体鱼
)
等
。
[0004]以往遭受入侵物种危害的地方需要耗费高额的成本来控制以及修复，大多数的应对措施大多缺乏足够的政策支持，或者已经错过了预防的最佳时机而以失败告终
。
现在研究工作的重点应该是在入侵物种对环境造成更大的破坏和进一步传播发生之前，在早期及时发现入侵物种的存在
。
因此，建立一种既经济又耗时短的应对方法前，早期识别检测入侵物种的存在，是有效应对未来生态系统进一步损害的关键手段
。
[0005]关于入侵物种识别与检测的研究还相对较少
。
传统的入侵物种检测方法包括进行视觉和声学调查，但具有一定的不足和局限性
。
目前检测入侵物种方法主要包括形态学鉴定以及分子生物学等方法
。
形态学鉴定是一种通过观察生物体的形态特征来确定其分类和鉴定的方法，可以直观地观察到结果，但这种鉴定方法对入侵物种早期阶段
(
如，害虫
)
的识别能力较差
。
利用分子生物学的方法进行早期识别主要依靠于环境
DNA(eDNA)
，该方法能在入侵物种生活的环境中收集其粪便或其生活所在环境的水样，并提取
DNA
，后可通过
PCR
进行多重检测，展示了环境
DNA(eDNA)
作为水环境中检测工具的功效
。
另外，将高通量测序
(HTS)
与
DNA
条形码结合在一起，也可用于检测入侵物种
。
[0006]近几年来，
CRISPR
‑
Cas
系统作为一个革新性的强大基因组编辑工具的出现在生物学界掀起了一场风暴，给核酸检测带来了巨大的应用前景
。CRISPR(
簇规则间隔短回文重复序列
)
‑
Cas
系统
(CRISPR
相关蛋白
)
是结合和切割外来核酸的原核适应性免疫系统，最初是在细菌和古细菌中得到确认
。Cas12a(
也称为
Cpf1)
是一种
RNA
引导的核酸酶，由单个
CRISPR RNA(crRNA)
和富含
T
的原间隔邻基序
(PAM)
序列引导，来切割靶标双链
DNA(dsDNA)。
当
Cas12a
与
crRNA(
又称
gRNA)
结合后，会形成具有核酸酶活性的核糖核蛋白复合体，当识别到靶标
DNA
时，会激活
Cas12a
切割双链靶标
DNA。
其切割活动可通过连接的荧光体
‑
淬灭体的
ssDNA
来检测，被激活的
Cas12a
会切割
ssDDNA
导致其裂解后发荧光
。
[0007]随着检测技术的不断发展，
CRISPR
‑
Cas12a
检测系统的开发成为了检测入侵物种的一种新策略，为早期识别检测入侵物种的存在提供可靠的方法
。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒
。
[0009]本专利技术的目的还在于提供一种采用上述试剂盒检测入侵物种的方法
。
[0010]本专利技术的最后一个目的在于提供上述试剂盒在制备检测入侵物种产品中的应用
。
[0011]本专利技术的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒，所述试剂盒包括
CRISPR
‑
Cas12a
检测体系和含有靶标的目的片段；其中所述
CRISPR
‑
Cas12a
检测体系包括
Cas12a
蛋白
、
入侵物种的特异性
gRNA、
淬灭荧光
DNA
报告探针
、
检测缓冲液和
ddH2O
，所述含有靶标的目的片段采用引物扩增获得
。
[0012]可选地，所述入侵物种的特异性
gRNA
为如
SEQ ID NO.1
所示固定茎环序列
+21nt Protospacer
序列
。
[0013]根据入侵物种基因序列选择高度保守区域基因的序列，即根据
PAM
后的
Protospacer
序列设计
gRNA
，即在靶标区域内找出
TTTN
序列，往后选取
21nt
，所述
gRNA
的序列为：
[0014]5'
‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU(
固定茎环本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒，其特征是：所述试剂盒包括
CRISPR
‑
Cas12a
检测体系和含有靶标的目的片段；其中所述
CRISPR
‑
Cas12a
检测体系包括
Cas12a
蛋白
、
入侵物种的特异性
gRNA、
淬灭荧光
DNA
报告探针
、
检测缓冲液和
ddH2O
，所述含有靶标的目的片段采用引物扩增获得
。2.
根据权利要求1所述的基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒，其特征是：所述入侵物种的特异性
gRNA
为如
SEQ ID NO.1
所示固定茎环序列
+21nt Protospacer
序列
。3.
根据权利要求2所述的基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒，其特征是：所述入侵物种为短盖巨脂鲤
、
埃及塘虱或淡水石斑，所述入侵物种的特异性
gRNA
为短盖巨脂鲤的特异性
gRNA、
埃及塘虱的特异性
gRNA
或淡水石斑的特异性
gRNA
，其中短盖巨脂鲤的特异性
gRNA
如
SEQ ID NO.2
所示，埃及塘虱的特异性
gRNA
如
SEQ ID NO.3
所示，淡水石斑的特异性
gRNA
如
SEQ ID NO.4
所示
。4.
根据权利要求3所述的基于
Crispr/Cas12a
系统检测入侵物种的试剂盒，其特征是：含有短盖巨脂鲤靶标的目的片段采用引物短盖巨脂鲤
‑
COX2
‑
F1
和短盖巨脂鲤
‑
COX2
‑
R1
扩增获得，所述短盖巨脂鲤
‑
COX2
‑
F1
的序列如
SEQ ID NO.5
所示，所述短盖巨脂鲤
‑
COX2
‑
R1
的序列如
SEQ ID NO.6
所示；含有埃及塘虱靶标的目的片段采用引物埃及塘虱
‑
COX1
‑
F1
和埃及塘虱
‑
COX1
‑
R1
扩增获得，所述埃及塘虱
‑
COX1
‑
F1
的序列如
SEQ ID NO.7
所示，所述埃及塘虱
‑
COX1
‑
R1
的序列如
SEQ ID NO.8
所示；含有淡水石斑靶标的目的片段采用引物淡水石斑
‑
COX1
‑
F1
和淡水石斑
‑
COX1
‑
R1
扩增获得，所述淡水石斑
‑
CO...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆，张敏琳，左小玲，梁建韬，黄枫淇，梁凯珊，韦丽云，卢柯宇，闫旭，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：