一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法和应用，包括：基因突变位点高深度测序检测，ddPCR或qPCR方法检测基因突变的生殖腺嵌合比例，根据生殖腺嵌合比例确定筛选囊胚、单精子或极体的数量；用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基因组扩增获得DNA产物，进行Sanger测序检测疑似致病变异或致病变异的存在与否；用全基因组SNP检测获得与该(疑似)致病变异连锁的单倍体型后进行家系连锁分析，选择无携带风险染色体的整倍体胚胎作为待移植胚胎，用于嵌合体型新发突变、无先证者或家系不全且无携带型胚胎作为先证者的单基因遗传病家系胚胎植入前SCN5A基因致病变异检测，具有重要应用价值。具有重要应用价值。具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法和应用


[0001]本专利技术属于胚胎植入前遗传检测领域，具体涉及一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法和应用。

技术介绍

[0002]单基因显性遗传病是指由单个基因缺陷导致的疾病，即一条同源染色体上存在致病基因即可发病。导致单基因显性遗传病的突变中，75％是新发突变、25％为遗传性，综合发病率约在1/270。对于常染色体显性遗传疾病的携带者，其子代携带即患病概率为50％，可以通过植入前检测进行胚胎阻断。胚胎植入前遗传学检测(PGT)是一项将辅助生殖与遗传学诊断相结合，阻断遗传性疾病传递的重要措施。与产前诊断相比，胚胎植入前基因诊断的优势在于可以减少孕产妇复发性流产以及中期引产的痛苦。胚胎植入前单基因遗传学检测(PGT
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M)针对已经有明确病因的遗传性疾病患者，利用分子遗传学诊断技术对胚胎进行筛选，选择不携带亲代致病变异的胚胎进行移植，从而获得健康子代，既阻断了遗传性疾病向子代传递，同时避免了生育患儿给患者及其家庭带来的精神压力和沉重的经济负担。
[0003]由于PGT
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M技术所检测的标本仅为1～2个卵裂球或5～6个囊胚滋养外胚层细胞(TE)，遗传物质的起始量较低，在扩增过程中可能出现两个等位基因的其中一个优势扩增，另一个扩增效率低或失败的现象，即等位基因脱扣(ADO)。ADO现象是导致PGT
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M误诊以及可移植胚胎数量减少的重要原因之一。采用连锁分析联合变异位点验证可以增加PGT诊断的准确率，降低ADO对胚胎PGT诊断的影响。根据《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》，现有胚胎检测的主要方法是同时进行突变位点的直接分析(一代测序)和遗传多态位点连锁分析，其中用于连锁分析的遗传多态位点可以是短串联重复序列(STR)或者单核苷酸多态位点(SNP)，如Karyomapping或二代测序技术。所以临床上对于携带常染色体显性疾病的夫妻进行PGT
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M通常有两种方法：1.若该家系存在其他的先证者(EAP)(兄弟姐妹先证者慎用)，可以利用该先证者的DNA样本构建单体型，通过连锁分析的方法进行胚胎阻断，该方法可以避免单独使用Sanger测序方法检测胚胎造成的脱扣和假阴性结果。2.若该家系无其他先证者，如夫妻一方为新发变异且尚未生育、或先证者死亡且未保留样本等情况，可以通过Sanger测序找到携带型胚胎作为先证者、再建立单体型进一步明确其他胚胎的携带情况。
[0004]事实上，新发突变也是一个普遍现象。Nature(H
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nsson et al.2017)的一篇论著发现，任何子代都存在平均70.3个新发突变，子代新发突变与父母年龄成正相关，父亲每增加1岁，孩子增加1.51个新发突变；母亲每增加1岁，孩子增加0.37个新发突变。新发突变发生在特定的致病或疑似致病位点，就可能导致疾病发生，这类基因新发突变，是绝大多数单基因显性遗传病的发病原因。随着社会压力增大和人口老龄化程度的不断加剧，高龄生育已成为一个不容忽视的社会现象，伴随PGT
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M技术的成熟和应用越来越广泛，遇到难以解决的新发变异案例越来越多。当该新发变异家系存在先证者缺失、且胚胎经Sanger检
测未发现携带致病变异的胚胎时，由于不能排除Sanger检测ADO的风险，直接移植胚胎有一定风险，并且若患者所获得胚胎数量较多但直接Sanger检测均未携带致病变异，还需要同时考虑患者可能存在性腺嵌合的情况。性腺嵌合是指性腺中存在两种及以上的细胞系，可能导致非孟德尔遗传的特点。在这种情况下，首先，通过深度靶向测序确定是否嵌合以及尽可能检测出生殖腺嵌合比例，对单精子或预留的第二极体PB2进行Sanger测序，找到携带变异的精子或极体作为先证者(SAP或PAP)建立单体型。性腺嵌合的比例将影响胚胎中携带的比例，也决定了分析多少个单精子或极体可能找到一个SAP或PAP，因此确认性腺嵌合的情况有助于对胚胎进行植入前的精确诊断。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的上述不足，本专利技术的主要目的是提供一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，针对新发突变、无先证者或家系不全的生殖腺嵌合男性患者进行单基因遗传病PGT生殖遗传干预，利用靶向深度测序、ddPCR或者qPCR方法检测基因突变生殖腺嵌合比例，根据嵌合比例确定需要筛选的囊胚、单精子或者极体的数量，利用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基因组扩增获得的DNA产物，进行Sanger测序检测筛选(疑似)致病变异的存在与否，利用全基因组SNP检测获得与该(疑似)致病变异连锁的单倍体型，建立家系单体型并进行胚胎的变异携带情况及全基因组拷贝数变异分析，从而选择无携带风险染色体的整倍体胚胎作为待移植胚胎。
[0006]本专利技术的另一目的是提供所述植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法应用于嵌合体型新发突变、无先证者或家系不全且无携带型胚胎作为先证者的单基因遗传病家系胚胎植入前SCN5A基因致病变异检测。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1：采集待测患者的样本进行基因突变位点高深度测序检测，ddPCR或qPCR方法检测基因突变的生殖腺嵌合比例，其中所述待测患者为新发突变、无先证者或家系不全的生殖腺嵌合男性患者；
[0010]步骤2：根据所述生殖腺嵌合比例确定筛选待测患者的囊胚、单精子或者极体的数量；
[0011]步骤3：用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基因组扩增获得DNA产物，进行Sanger测序检测疑似致病变异或致病变异的存在与否；
[0012]步骤4：用全基因组SNP检测获得与该疑似致病变异或致病变异连锁的单倍体型；
[0013]步骤5：基于获得的单倍体型进行家系单体型连锁分析；
[0014]步骤6：以单精子检测为突变型样本作为参照，经过全基因组拷贝数变异和家系单体型连锁分析，选择无携带风险染色体的整倍体胚胎作为待移植胚胎。
[0015]作为优选，所述待测患者的样本为外周血、精液或者唾液。
[0016]作为优选，所述基因为SCN5A基因。
[0017]作为优选，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0018]作为优选，步骤3中，所述用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基因组扩增获得DNA
产物，包括：根据所述待测患者的生殖腺嵌合率预测发现一枚突变携带胚胎需检测的囊胚数量，根据女性年龄和卵巢功能因素预测能够获得的囊胚数量，从而确定是否需要先进行单精子或极体筛选；当估计需检测的囊胚数等于或小于平均每个周期预期获得的囊胚数时，进行囊胚检测；当需检测的囊胚数大于平均每个周期能够获得的囊胚数时，先进行单精子或极体筛选，再进行囊胚检测。
[0019]本专利技术的植入前胚胎排除风险染色体的单基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：采集待测患者的样本进行基因突变位点高深度测序检测，ddPCR或qPCR方法检测基因突变的生殖腺嵌合比例，其中所述待测患者为新发突变、无先证者或家系不全的生殖腺嵌合男性患者；步骤2：根据所述生殖腺嵌合比例确定筛选待测患者的囊胚、单精子或者极体的数量；步骤3：用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基因组扩增获得DNA产物，进行Sanger测序检测疑似致病变异或致病变异的存在与否；步骤4：用全基因组SNP检测获得与该疑似致病变异或致病变异连锁的单倍体型；步骤5：基于获得的单倍体型进行家系单体型连锁分析；步骤6：以单精子检测为突变型样本作为参照，经过全基因组拷贝数变异和家系单体型连锁分析，选择无携带风险染色体的整倍体胚胎作为待移植胚胎。2.根据权利要求1所述植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，其特征在于，所述待测患者的样本为外周血、精液或者唾液。3.根据权利要求1所述植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，其特征在于，所述基因为SCN5A基因。4.根据权利要求3所述植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，其特征在于，所述引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求1所述植入前胚胎排除风险染色体的单基因缺陷检测方法，其特征在于，步骤3中，所述用囊胚、单精子或者极体的单细胞全基...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖敏，隋宜伦，伏静，孙晓溪，
申请(专利权)人：上海集爱遗传与不育诊疗中心有限公司，
类型：发明
国别省市：