一种同时鉴别胚胎染色体结构异常和致病基因携带状态的方法技术

一种同时鉴别胚胎染色体结构异常和致病基因携带状态的方法。本发明专利技术属于遗传诊断和人类辅助生殖领域。本发明专利技术以家系全基因组单体型分析模型为基础，构建出一种综合性的通用技术方法，该方法仅通过一次检测，不仅能检测出胚胎的致病基因，也同时能检测出胚胎的染色体非整倍体和染色体结构异常，为遗传病患者的胚胎精准诊断提供指导，具有重要临床意义。具有重要临床意义。具有重要临床意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同时鉴别胚胎染色体结构异常和致病基因携带状态的方法
[0001]本申请要求于2020年5月22日提交中国专利局，申请号为202010443663.6，专利技术名称为“一种同时鉴别胚胎染色体结构异常和致病基因携带状态的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术属于基因诊断和人类辅助生殖领域，具体而言，涉及一种同时鉴别胚胎染色体平衡结构异常和致病基因携带状态的方法。

技术介绍

[0003]单基因遗传病是指单个或单对等位基因突变导致身体结构发育或生理功能异常的疾病，一般遵循孟德尔遗传规律。目前明确的单基因疾病的种类已经超过1万种，由于单基因疾病种类众多，人群总体发病率约为1％，给数千万家庭和患者带来巨大的经济及精神负担。在很长一段时间，受到检测技术的限制，单基因疾病既不能防也不能治。随着分子生物学技术的快速发展，很多单基因疾病已经可以通过产前诊断技术进行胎儿期的诊断，或通过辅助生殖技术进行胚胎期的诊断，以预防缺陷患儿的出生。但由于产前诊断对孕周的要求及引产带来的多种损伤，越来越多的家庭选择辅助生殖技术进行疾病阻断，即通过胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing
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Monogenic disease，PGT
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M)技术在胚胎期做出诊断后，选择不患病的胚胎进行移植。
[0004]PGT
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M检测方法主要包括一代测序法和单体型分析法，一代测序法应用较早，该方法可以直接对胚胎活检细胞进行突变位点的检测，但由于存在等位基因脱扣(Allele drop
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out)，会存在较高的误诊率。单体型分析法是指对致病基因上下游选取遗传标记，如短串联重复序列(Short tandem repeats，STR)或单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)位点，在有先证者的家系中通过连锁分析确定胚胎致病基因的携带状况。如果选用STR位点，须针对每一种单基因疾病进行STR设计，并且通过家系验证后才能用于PGD，该过程需要时间较长并且费用高，而且基因组中STR遗传标记分布较少，有些致病基因附近没有足够的STR用于单体型分析。SNP遗传标记相比STR含有更丰富的遗传信息，平均每300
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500个碱基就会有1个，近几年在单基因疾病的PGT
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M中应用较多。但传统单体型分析法由于技术的限制，在检测目标致病基因突变的同时，无法检测胚胎染色体的整倍体性，使通过PGT
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M检测后为基因非致病性的胚胎，仍有可能为染色体非整倍体(包括完全非整倍体和部分非整倍体)，进而造成胚胎移植后出现流产或出生缺陷等不良结局，因此需要实验再次进行非整倍体检测。且要求必须要有先证者的存在，对于无先证者的病例难以通过常规辅助生殖技术阻断。
[0005]染色体结构异常又称染色体重排，是指染色体或染色单体经过断裂
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重换或互换机理产生的染色体畸变，临床上主要包括染色体平衡易位和染色体倒位，与不孕不育、复发性流产、死胎、死产、新生儿发育迟缓及其他先天畸形等不良妊娠结局密切相关，是导致不
孕不育症和早期复发性流产的重要原因。染色体平衡易位主要包括相互易位和罗伯逊易位，在人群中的发病率约为0.27％，在反复自然流产人群中发病率可高达3.81％。染色体倒位根据断裂点的位置是否包含着丝粒分为臂内倒位和臂间倒位，在我国生育障碍人群中致病性倒位的发病率约为0.22％。不经干预早期流产率可达90％以上，给女性患者造成反复的清宫手术、感染、宫腔粘连等，对育龄妇女的身体和精神方面的健康状态造成重大影响。这些人群很难自然妊娠，目前临床上主要通过辅助生殖技术胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing
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Structural Rearrangements，PGT
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SR)，筛选患者的染色体整倍体胚胎进行移植以改善妊娠结局，检测方法主要包括荧光原位杂交技术、实时荧光定量核酸扩增、基因芯片、二代测序等，PGT
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SR是这些夫妻的主要助孕方法，可以降低由染色体数目异常引起的出生缺陷问题。
[0006]但这些临床常用的PGT
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SR检测方法存在共同的局限性：仅可以检测胚胎染色体非整倍体，却不能检测胚胎的染色体结构异常，即不能进一步将整倍体胚胎中的染色体结构异常与结构正常两种类型胚胎进行区分。这就会造成传统PGT
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SR生育的新生儿中理论上有50％仍是染色体结构异常携带者，这部分新生儿到成年婚育时会发生与其父母相同的不孕不育、复发性流产等危害生殖健康的病症。因此，如何突破传统技术，在胚胎植入前同时检测出胚胎的染色体结构异常和染色体非整倍体，优先移植染色体整倍体和结构均正常的胚胎，从根本上阻断该遗传性疾病的遗传传递，同时解决患者自身目前的生育困难和下一代成年后潜在的生育风险。
[0007]近年来，国内外研究在染色体结构异常筛查方面有一些相关技术报道，但是这些方法存在较大的局限性：首先只能对胚胎的染色体结构异常和染色体非整倍体分别进行检测，需要多次检测实验操作；其次需要根据病人染色体的断裂点位置进行个体化设计，技术相对复杂、耗时长，不具有通用性，难以在生殖中心进行推广应用。而我们前期的研究创新性地避开了直接对胚胎断裂点检测的困难，通过家系样本收集，将患者夫妻双方和一位参照样本构建家系单体型，进行胚胎染色体非整倍体检测同时，通过连锁分析明确结构异常染色体的单体型和结构正常染色体的单体型，确立胚胎染色体结构异常检测模型，通过识别胚胎是否携带结构异常染色体单体型，来对胚胎染色体结构进行精准区分，即一次检测同时能完成染色体结构异常和染色体非整倍体的分析。
[0008]由于单基因疾病和染色体结构异常在人群中发病率均较高，同时携带这两类遗传病的患者在人群中有一定的比例，而且这些患者基本没有单基因疾病的先证者，由于检测技术的限制，截止目前未有对这类患者群体的辅助生殖治疗相关检测技术报道。本研究希望构建出一种新的检测技术方法，能够对同时携带单基因疾病致病突变和染色体结构异常的病例进行精准的胚胎植入前遗传学检测，即通过一次检测，同时在胚胎期检测出基因异常、染色体非整倍体和染色体结构的异常，移植基因和染色体均正常的胚胎，从根本上阻断向下一代的遗传，预防出生缺陷，是临床亟待解决的难题，是精准医学的要求，对提高人群生殖健康水平和降低出生缺陷具有重要意义。

技术实现思路

[0009]针对上述现有技术中存在的空白，本专利技术以家系全基因组单体型分析模型为基础，构建出一种综合性的通用技术方法，该方法仅通过一次检测，不仅能检测出胚胎的致病
基因，也同时能检测出胚胎的染色体非整倍体和染色体结构异常，多种异常无需分别检测，为遗传病患者的胚胎精准诊断提供指导。
[0010]本专利技术的具体技术方案如下：
[0011]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别胚胎染色体结构异常和/或致病基因携带状态的家系单体型中参照样本单体型的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本基因分型：将以下对象进行大规模SNP基因型检测：a.染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方；和，b.至少一名携带者亲属、携带致病基因的子代、或染色体异常的胚胎；其中，携带者亲属可为与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属，也可为染色体和/或基因正常的亲属；将上述a和b称为参照样本；(2)确定信息SNPs位点：a.当参照样本中包含携带者亲属时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；b.当参照样本中包含携带致病基因的子代或染色体异常的胚胎时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；(3)构建家系单体型中参照样本单体型：集合步骤(2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖致病基因、致病基因所在染色体和与其相对应的等位基因所在的同源染色体、两处染色体结构异常断裂点区域、结构异常染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，获得家系单体型中参照样本单体型。2.一种用于鉴别胚胎染色体结构异常和/或致病基因携带状态的家系单体型中参照样本单体型的构建系统，所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件，其特征在于，(1)所述系统还包含储存有参照样本的大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件；所述参照样本为：a.染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方；和b.至少一名携带者亲属、携带致病基因的子代、或染色体异常的胚胎；其中，携带者亲属可为与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属，也可为染色体和/或基因正常的亲属；(2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点：a.当参照样本中包含携带者亲属时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；b.当参照样本中包含携带致病基因的子代或染色体异常的胚胎时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；(3)所述软件依照下述原则构建家系单体型中参照样本单体型：集合步骤(2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖致病基因、致病基因所在染色体和与其相对应的等位基因所在的同源染色体、两处染色体结构异常断裂点区域、结构异常染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，获得家系单体型中参照样本单体型。3.一种用于鉴别胚胎染色体结构异常和/或致病基因携带状态的家系单体型的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本基因分型：将以下对象进行大规模SNP基因型检测：a.染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方；b.至少一名携带者亲属、携带致病基因的子代、或染色体异常的胚胎；和，c.a所述携带者夫妇的体外受精胚胎；
其中，携带者亲属可为与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属，也可为染色体和/或基因正常的亲属；将上述a和b称为参照样本；c称为待定样本；(2)确定信息SNPs位点：a.当参照样本中包含携带者亲属时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；b.当参照样本中包含携带致病基因的子代或染色体异常的胚胎时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；(3)构建家系单体型：集合步骤(2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖致病基因、致病基因所在染色体和与其相对应的等位基因所在的同源染色体、两处染色体结构异常断裂点区域、结构异常染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型。4.一种用于鉴别胚胎染色体结构异常和/或致病基因携带状态的家系单体型的构建系统，所述系统包含能够计算处理样本数据的软件、和用于承载上述软件的硬件，其特征在于，(1)所述系统还包含储存有参照样本和待定样本的大规模SNP基因型检测的基因分型数据的硬件；所述参照样本为：a.染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方；和b.至少一名携带者亲属、携带致病基因的子代、或染色体异常的胚胎；所述待定样本为所述携带者夫妇的体外受精胚胎；其中，携带者亲属可为与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属，也可为染色体和/或基因正常的亲属；(2)所述软件根据下述规则确定信息SNPs位点：a.当参照样本中包含携带者亲属时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；b.当参照样本中包含携带致病基因的子代或染色体异常的胚胎时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；(3)所述软件依照下述原则构建家系单体型：每条染色体上依照上述标准选取的信息SNPs位点，通过家系连锁分析得到覆盖致病基因、致病基因所在染色体和与其相对应的等位基因所在的同源染色体、两处染色体结构异常断裂点区域、结构异常染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型。5.如权利要求1
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4任一项所述方法或系统，其特征在于，所述染色体结构异常包括染色体平衡易位和染色体倒位。6.如权利要求5所述方法或系统，其特征在于，所述染色体平衡易位包括相互易位和罗伯逊易位。7.一种用于鉴别胚胎染色体结构异常和/或致病基因携带状态的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)样本基因分型：将以下对象进行大规模SNP基因型检测：a.染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方；b.至少一名携带者亲属、携带致病基因的子代、或染色体异常的胚胎；和，c.a所述携带者夫妇的体外受精胚胎；
其中，携带者亲属可为与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属，也可为染色体和/或基因正常的亲属；将上述a和b称为参照样本；c称为待定样本；(2)确定信息SNPs位点：a.当参照样本中包含携带者亲属时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型，并且在携带者亲属中也是纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；b.当参照样本中包含携带致病基因的子代或染色体异常的胚胎时，在染色体结构异常和/或致病基因携带者中为杂合型，在其配偶中为纯合型的SNP位点为信息SNPs位点；(3)构建家系单体型：集合步骤(2)确定的信息SNPs位点通过家系连锁分析得到覆盖致病基因、致病基因所在染色体和与其相对应的等位基因所在的同源染色体、两处染色体结构异常断裂点区域、结构异常染色体整条染色体及其同源染色体的整条染色体的单体型，不同染色体单体型的集合称为家系单体型；(4)数据收集和分析：1)当以染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方，和，与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属为参照样本时：a.若待定样本的致病基因或染色体结构异常断裂点区域没有发生同源重组，当待定样本致病基因或染色体结构异常断裂点区域单体型信息和携带者以及与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属的单体型信息一致时，则待定样本判断为致病基因携带或染色体结构异常携带胚胎；当待定样本致病基因或染色体结构异常断裂点区域单体型信息与参照样本中结构异常和/或致病基因携带者单体型信息一致，但和与携带者具有相同染色体结构异常和/或致病基因的亲属的单体型信息不一致时，则待定样本判断为非致病基因携带或非染色体结构异常携带胚胎；b.若待定样本的致病基因或染色体结构异常断裂点区域发生了同源重组：i.若染色体结构异常为染色体平衡易位，则判断标准与a相反；ii.若染色体结构异常为染色体倒位，则判断标准为，当只有其中1个断裂点区域的一端或两端发生同源重组，则判断规则与a相同；当2个断裂点区域中均仅有一端发生同源重组，则判断规则与a相同；当2个断裂点区域的两端均发生同源重组，则判断结果与a相反；2)当以染色体结构异常和/或致病基因携带者夫妇双方，和，染色体正常的亲属为参照时：a.若待定样本的致病基因或染色体结构异常断裂点区域没有发生同源重组，当待定样本致病基因或染色体结构异常断裂点区域单体型信息，与携带者及与携带者的染色体正常的亲属的单体型信息一致时...

【专利技术属性】
技术研发人员：张硕，雷彩霞，孙晓溪，徐丛剑，
申请(专利权)人：上海集爱遗传与不育诊疗中心有限公司，
类型：发明
国别省市：