一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组、试剂盒、检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别涉及一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组
、
试剂盒
、
检测方法及应用
。

技术介绍

[0002]癫痫俗称“羊角风”或“羊癫风”，是由多种病因引起的神经元异常放电导致的最常见的脑部慢性疾病，其特征为重复性和自发性，对患者的大脑
、
神经及其他组织器官均有不同程度的损害，严重影响患者身心健康和生活质量
。
据中国最新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为
7.0
‰
，年发病率为
28.8/10
万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为
4.6
‰
，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病
。
[0003]目前，丙戊酸钠作为广谱抗癫痫药物是临床上治疗癫痫疾病常用的一线治疗药物，虽然其口服吸收迅速，生物利用度高，但其治疗窗窄，药物反应呈现较大的个体差异，诸多研究证实丙戊酸钠药物反应差异除了包括年龄
、
体重
、
肝肾功能等生理病理因素，基因多态性对其影响颇深
。
研究资料显示，丙戊酸钠在人体内主要经肝脏代谢，主要代谢途径有3条：约
10
％左右经
CYP450
酶系氧化代谢
(CYP450)
；约
50
％经葡糖醛酸酶代谢/>(UGTs)
；约
40
％左右经线粒体内
β
氧化代谢，其余1％～3％以原型经尿液排出
。
其中，
CYP2C9
位于
10q23.3
号染色体，长度约
390kb
，其多态性可导致酶活性的改变，影响丙戊酸钠代谢，导致血药浓度的个体差异，
CYP2C9*3(1075A
＞
C)C
等位基因是癫痫的易感基因
。
此外，线粒体聚合酶
γ
(POLG1)
基因所编码的
POLG
是唯一位于线粒体并参与与线粒体
DNA
复制与修复的酶，其基因突变会影响线粒体的功能，导致难治性癫痫并且
POLG
基因的罕见突变可引起
Alpers
‑
Huttenlocher
综合征，已经证明
POLG
突变与丙戊酸钠诱导的肝毒性有直接关系，
POLG c.3708G>T
突变与丙戊酸钠诱发的肝衰竭有关，具有
POLG c.3428A>G
突变纯合子的患者存在寿命缩短
、
严重者面临死亡的风险，且杂合突变患者肝衰竭预后更差
。
因此
POLG c.3708G>T
和
POLG c.3428A>G
基因分型识别出存在致命后果的高风险个体对降低药物的不良反应具有重要的临床意义
。
[0004]目前，现有技术中关于检测癫痫疾病相关基因多态性位点的技术绝大多数均采用飞行时间质谱技术，如中国专利号
CN109468379A
，公开了采用飞行时间质谱技术检测抗癫痫类药物相关的基因的
SNP
位点，其检测过程涉及先通过
PCR
扩增出含有
SNP
位点的一段
DNA
，然后用
SAP
酶去除掉
PCR
体系中剩余的
dNTP
和引物，再加入一单碱基延伸引物进行延伸反应，最后进行质谱分析
。
整个检测过程对
DNA
的纯度要求特别高，步骤繁琐，操作环境和设备都有一定的要求，对操作人员的要求比较高且需要精密的检测设备，成本高；此外，中国专利号
CN113136424B
公开了采用下一代基因测序技术检测用于抗癫痫药物个体化用药的基因突变位点，虽然该方法具备高通量
、
多位点的优势，但是存在步骤繁琐，试验周期长
、
成本高
、
检测项目较为冗余等问题，不利于临床大面积推广的缺点
。
目前大多数研究均忽略了
POLG c.3428A>G
位点的检测，而
POLG c.3428A>G
位点的突变则与丙戊酸钠用药引起的不良
反应之一致命风险相关，因此开发出操作简单
、
费用低廉且同时检测
CYP2C9 c.1075A>C、POLG c.3708G>T
和
POLG c.3428A>G
的检测试剂盒是十分有必要的
。
本专利技术基于
ARMS PCR
检测技术致力于开发一种操作简单
、
特异性强
、
灵敏度高
、
可靠性强且成本低的检测方案
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的专利技术目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组
、
试剂盒
、
检测方法及应用，以解决现有技术问题存在的不足
。
[0006]本专利技术采用的技术方案如下：一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组，包括用于检测
CYP2C9 c.1075A>C、POLG c.3708G>T
和
POLG c.3428A>G
位点的
ARMS
引物探针组合物，
ARMS
引物探针组合物的核苷酸序列如表1所示：
[0007]表1[0008][0009]其中，所述用于检测
CYP2C9 c.1075A>C
位点的
ARMS
引物探针组合物为：核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向野生型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示的正向突变型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示的通用引物以及核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示的荧光探针；
[0010]所述用于检测
POLG c.3708G>T
位点的
ARMS
引物探针组合物为：核苷酸序列如
SEQID NO.5
所示的正向野生型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示的正向突变型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的引物探针组，其特征在于，包括用于检测
CYP2C9 c.1075A>C、POLG c.3708G>T
和
POLG c.3428A>G
位点的
ARMS
引物探针组合物，
ARMS
引物探针组合物的核苷酸序列如表1所示：表1其中，所述用于检测
CYP2C9 c.1075A>C
位点的
ARMS
引物探针组合物为：核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的正向野生型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示的正向突变型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示的通用引物以及核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示的荧光探针；所述用于检测
POLG c.3708G>T
位点的
ARMS
引物探针组合物为：核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示的正向野生型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示的正向突变型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示的通用引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
所示的荧光探针；所述用于检测
POLG c.3428A>G
位点的
ARMS
引物探针组合物为，核苷酸序列如
SEQ ID NO.9
所示的正向野生型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.10
所示的正向突变型引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.11
所示的通用引物，核苷酸序列如
SEQ ID NO.12
所示的荧光探针
。2.
如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光探针的5’
端连接有荧光基团，其3’
端连接有淬灭基团，所述荧光基团选自
FAM、HEX、TEXAS RED
和
CY5
其中任意一种荧光染料，所述淬灭基团选自
BHQ1
或者
BHQ2。3.
一种用于检测丙戊酸钠代谢相关基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组
、
用于处理待测样本的核酸释放剂
、
阳性对照和阴性对照
。4.
如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测人基因组
DNA
内标基因通用引物和通用探针，所述内标基因选自
RPPH
，所述检测人基因组
DNA
内标基因通
用引物的核苷酸序列如表1中的
SEQ ID NO.13
‑
14
所示，所述通用探针的核苷酸序列如表1中的
SEQ ID NO.15
所示
。5.
如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于处理待测样本核酸释放剂包括
SDS、
甲酰胺
、HCl
组分；所述阳性对照为所有目标基因靶序列多态性位点的
DNA
重组质粒；所述阴性对照为生理盐水
。6.
如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于检测
CYP2C9 c.1075A>C
位点的正向野生型引物
、
通用引物和荧光探针，与用于检测
POLG c.3708G>T
位点的正向突变型引物
、
通用引物和荧光探针，与用于检测
P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，李红东，邓波，范亮波，杨静静，郭晓蓉，苗保刚，
申请(专利权)人：西安天隆科技有限公司，
类型：发明
国别省市：