【技术实现步骤摘要】
一种食源性致病菌特异性超灵敏检测微流控生物芯片的制备方法及其应用
[0001]本专利技术属于食品检测
，尤其是一种食源性致病菌特异性超灵敏检测微流控生物芯片的制备方法及其应用
。
技术介绍
[0002]全球每年发生食源性疾病约6亿人次，死亡人数约
42
万，其中大部分由食源性致病菌引起
。
食源性致病菌在生鲜农产品贮运销过程中生长繁殖快，快速灵敏检测对保障人民群众健康安全具有重要意义
。
灵敏检测方法主要有分离鉴定法
、
酶联免疫法
(ELISA)、
金标试纸法
、
聚合酶链式反应
(PCR)
等，但普遍存在检测周期长
、
步骤繁冗的不足
。
基于微流控生物芯片的传感检测方法，因微型化
、
易集成
、
高通量等优点成为研究热点和发展趋势
。
但是，目前制约微流控生物芯片产业化应用的根本问题是灵敏度和准确度无法满足真实样品检测需求，主要问题有3个：
(1)
易污染，生物芯片的识别界面易被食品基质污染，导致界面非特异性吸附杂质，降低识别界面灵敏度；
(2)
易脱靶，适配体在微流控高通量体系中对快速层流的目标菌识别捕获率低；
(3)
易产生假阳性，食品基质中活性小分子靶标类似物优先占据识别界面结合位点，导致假阳性
。
[0003]目前，适配体修饰的微流控生物...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种食源性致病菌特异性超灵敏检测微流控生物芯片的制备方法，其特征在于：所述方法采用化学气相沉积
、
酰胺化反应
、
光刻胶蚀刻对微流控芯片的识别界面修饰聚对二甲苯改性，利用酰胺化反应修饰聚酰胺基胺树状大分子和滚环扩增引物，建立双重屏污涂层修饰模式，降低
PDMS
表面对食品基质中杂菌
、
蛋白质
、
多糖
、
脂类和小分子色素的非特异性吸附问题；利用滚环扩增引物，应用超分支滚环扩增合成长爪状复合适配体和识别界面原位修饰，提高流体状态下的识别和捕获性能；最后通过包含免疫荧光磁珠的新型螺旋筛分离微管进行磁层析分离，将标记的目标菌富集到指定磁吸区域，实现荧光信号聚集和增强
。2.
根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)PDMS
微流控芯片制作及间种式复合屏污涂层修饰模式构建
①
芯片设计
、
制作使用
AutoCAD、Solidworks
软件绘制和设计微流控芯片，设计完成后制备光掩膜；以常规光刻和软光刻技术制作微流控芯片，利用正光刻胶制作模版微结构；为了制备
PDMS
表面，采用了标准的软光刻工艺，得到
PDMS
软硅胶管道；
②
间种式复合屏污涂层修饰模式构建：
PDMS
软硅胶管道打孔，之后在软硅胶管道侧表面覆盖并固定镂空正光刻胶，然后进行聚对二甲苯表面修饰，采用化学气相沉积法在
PDMS
表面修饰聚对二甲苯涂层，之后
30s
，
2300rpm
旋涂
SU
‑8光敏材料后，
65℃
烘焙
5min
后升温至
95℃
烘焙
20min
后冷却到室温，再经紫外照射处理
3000s
，之后将其在
65℃
烘烤
5min
后升温至
95℃
烘烤
12min
后冷却至室温；管道表面经过上述处理后，使得聚对二甲苯小分子镂空铺满
PDMS
管道表面；
PDMS
键合：之后再经空气等离子
0.5mbar
处理
1min
后，再经氧等离子
0.4mbar
处理
1.5min
后，快速粘合玻璃片基底，于
80℃
烘烤
2h
后冷却至室温，形成微流控芯片；在聚对二甲苯之上继续修饰聚酰胺基胺树状大分子，形成规律排布的套种式双效屏污涂层；
③
PDMS
芯片微管道表面接枝滚环扩增引物及锁式探针：
PDMS
管道表面胺化：将经步骤
(1)
②
处理后的
PDMS
管道用等离子清洁器在
100mTorr
，
118W
下处理氧等离子体，持续
10s
；等离子体处理后，立即用
(
以质量浓度计
)0.2
‑1％
APTMS
溶液处理已活化的
PDMS
管道
1h
，流速
0.05mL/h
，以
PDMS
管道通过硅醇缩合形成表面
‑
NH2，再用
PBS
缓冲液洗涤管道以除去多余的
APTMS
溶液，之后将
PDMS
管道
50
‑
70℃
风干
30min
；
EDC
和
NHS
在
MES
缓冲液
(pH
＝
4.5)
中稀释得到
EDC
‑
NHS
溶液，
EDC
的终浓度为
40mg/mL
，
EDC
：
NHS
的摩尔比为1：1；使用注射泵在通道内灌注
EDC
‑
NHS
溶液，流速＝
20
μ
L/min
，分配体积＝
100
μ
L
；孵育
15min
后，用
0.1M PBS
缓冲液以流速
100
μ
L/min、
配液量
300
μ
L
冲洗通道，之后将充满该
PBS
缓冲剂的管道封闭进出口，使该微流控芯片处于备用状态；
(2)
超分支长爪状复合适配体多联位点特异性识别捕获
E.coli O157:H7
①
不同生长时期
E.coliO 157:H7
适配体序列优选及结构功能分析选用3个不同生长时期
E.coliO157:H7
适配体序列
SEQ ID No.1
‑3，分析其亲和性；将5’‑
FAM
标记的适配体序列用1×
TE
冲液配稀释配制成
10pmol/L
溶液；取不同体积的
10pmol/L
适配体稀释为不同浓度梯度
(10
，
50
，
100
，
150
，
200nmol/L)
，于
95℃
变性
3min
，立即冰浴冷却
5min
；将适配体溶液加入处理好的目标菌液中，在
37℃
下缓慢振荡孵育
1h
；然后用1×
BB
缓冲液清洗重悬后进行流式细胞分析，以没有添加适配体的细菌细胞液作为空白对照，测定前向角散射
、
侧向角散射及荧光强度；绘制各个适配体的饱和结合曲线图，计算
K
d
值，明
确优选适配体的亲和力和特异性良好，选择滚环扩增反应以提高目标菌的抓取率；
(2)
超分支滚环扩增序列设计及滚环扩增反应条件
①
超分支滚环扩增序列设计前述优选适配体序列为滚环扩增模板和引物设计提供依据，其中滚环扩增序列为适配体序列的互补序列
。
适配体的核苷酸序列为
SEQ ID No.1
‑3，引物为引物
1、
引物
2、
引物3和引物4，引物
1、
引物
2、
引物3和引物4的核苷酸序列依次为
SEQ ID No.4
‑
...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜瑜倩，汤尧，李喜宏，姜丛晨，李学进，李文瀚，梁富浩，李丹丹，苗泽，张瑞，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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