一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，公开了一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法，所述方法在大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法、重组大肠杆菌及应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法
、
重组大肠杆菌及应用
。

技术介绍

[0002]到目前为止，已经发现了
100
多种不同类型的
RNA
修饰，这些修饰大多存在于
rRNA、tRNA
和
snRNA
中
。
最常见和最早发现的修饰之一是从尿苷到假尿苷的异构化
。
近年来，随着人们对
RNA
疫苗的关注和研究，将假尿苷及其类似物替换尿苷加入
mRNA
，能提高
mRNA
的稳定性并增强其翻译能力，可以解决
mRNA
药物容易被免疫系统识别而被清除
、
产生免疫副反应的问题
。
假尿苷作为一种
RNA
的代谢产物，具有仅从肾脏排泄的特点，在临床医学上可用于监测肿瘤的发生
、
发展及肾病的诊治
。
假尿苷具有十分重要的应用价值，随着假尿苷市场需求量的不断扩大，使得人们在假尿苷的合成方法上开始投入了越来越多的研究
。
[0003]1961
年，首次报道了化学合成假尿苷的方法，但总收率仅为2％，且产物为
α
和
β
异构体的混合
。
目前，假尿苷的生产方法主要有化学合成法
、
化学
‑
酶法和酶催化法
。
李静简等
(202210798651.4)
以2，3，5‑
三苄氧基
‑
D
‑
核糖酸
‑1，4‑
内酯与2，4‑
二烷氧基
‑5‑
溴嘧啶为原料通过加成
、
还原
、
脱保护基等反应后得到假尿苷；金峰等
(202210473532.1)
以
D
‑
核糖和尿嘧啶为起始反应物经有机溶剂通过加成
、
缩合
、
脂肪酶拆分
、
脱保护基等反应后得到假尿苷，但两种化学合成方法均存在步骤繁琐
、
收率较低的问题
。
肖聪等
(2021111581013.9)
使用化学
‑
酶法合成假尿苷，先化学合成5‑
磷酸核糖，再用假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶催化5‑
磷酸核糖与尿嘧啶合成假尿苷单磷酸，最后去磷酸化得到假尿苷，产量为
7.9g/L
，转化率为
51
％
。
陈伟等
(202111581013.9)
将来自于
Streptomyces sp.ID38640
中的假尿苷合成基因
pumH、pumJ
和
pumD
克隆至大肠杆菌体内，
96h
可转化
10g/L
肌苷产
7.2g/L
假尿苷
。
朱文娟等
(202310168205X)
利用重组大肠杆菌分别表达尿苷磷酸化酶
UdP、
嘌呤核苷磷酸化酶
DeoD、
磷酸戊糖变位酶
DeoB
以及假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶
YeiN
，再将酶液混合，
24h
可转化尿苷产生
1.16g/L
假尿苷，转化率为
95
％
。
但以上方法普遍存在步骤复杂繁琐
、
生产成本高
、
生产效率低
、
产品难于回收纯化等缺点，导致产品售价较高，限制了其在生物和医药领域中的大规模应用
。
因此，迫切需要开发廉价的
、
适合工业化放大的假尿苷生产工艺
。
[0004]全细胞生物催化法主要借助细胞内的酶进行催化，成为介于发酵法与纯酶催化法之间的生物技术
。
该方法不仅可以实现酶的级联反应，提高酶的催化效率，更能大大减少酶的纯化过程，使生产成本得到有效控制
。
因而，胞内的酶在细胞膜或细胞壁的保护下，可具备更高的稳定性与更长的半衰期，易实现催化的高效性
。
利用全细胞催化法生产核苷类产品是近年来研究的热点
。
本专利技术在大肠杆菌
E.coli MG1655
中构建了新颖的酶催化反应路线，实现了以尿苷或胞苷为底物全细胞催化制备假尿苷新工艺
。
[0005]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷的方法
、
重组大肠杆菌及应用
。
[0007]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一种能够全细胞催化制备假尿苷的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌
E.coli MG1655
中过表达假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达胞嘧啶脱氨酶，过表达核苷渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白，获得重组大肠杆菌
。
[0009]进一步地，所述假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶为大肠杆菌
yeiN
基因编码的蛋白，大肠杆菌
yeiN
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
[0010]所述核糖激酶为大肠杆菌
rbsK
基因编码的蛋白，大肠杆菌
rbsK
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；
[0011]所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌
rihA
基因或大肠杆菌
rihB
基因或大肠杆菌
rihC
基因编码的蛋白，大肠杆菌
rihA
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，大肠杆菌
rihB
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示，大肠杆菌
rihC
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；优选大肠杆菌
rihA
基因编码的蛋白；
[0012]所述胞嘧啶脱氨酶为大肠杆菌
codA
基因编码的蛋白，大肠杆菌
codA
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种能够全细胞催化制备假尿苷的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是在大肠杆菌
E.coli MG1655
中过表达假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶，过表达核糖激酶，过表达核糖核苷水解酶，过表达胞嘧啶脱氨酶，过表达核苷渗透酶，不表达假尿苷转运蛋白，获得重组大肠杆菌
。2.
根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶为大肠杆菌
yeiN
基因编码的蛋白，大肠杆菌
yeiN
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述核糖激酶为大肠杆菌
rbsK
基因编码的蛋白，大肠杆菌
rbsK
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所述核糖核苷水解酶为大肠杆菌
rihA
基因或大肠杆菌
rihB
基因或大肠杆菌
rihC
基因编码的蛋白，大肠杆菌
rihA
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，大肠杆菌
rihB
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示，大肠杆菌
rihC
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；所述胞嘧啶脱氨酶为大肠杆菌
codA
基因编码的蛋白，大肠杆菌
codA
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示；所述核苷渗透酶为大肠杆菌
nupC
基因编码的蛋白，大肠杆菌
nupC
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示；所述假尿苷转运蛋白为大肠杆菌
psuT
基因编码的蛋白，大肠杆菌
psuT
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
所示
。3.
根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)
将核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示的假尿苷
‑5‑
磷酸糖苷酶基因
yeiN
与启动子
P
trc
的融合片段
P
trc
‑
yeiN
连接到质粒
pTrc99a
Δ
lacI
中获得质粒
P1
；
(2)
将核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示的核糖激酶基因
rbsK
与启动子
P
trc
的融合片段
P
trc
‑
rbsK
连接到质粒
P1
中获得质粒
P2
；
(3)
将核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示的核糖核苷水解酶基因
rihA
与启动子
P
trc
的融合片段
P
trc
‑
rihA、
核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示的核糖核苷水解酶基因
rihB
与启动子
P
trc
的融合片段
P
trc
‑
rihB、
核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示的核糖核苷水解酶基因
rihC
与启动子
P
trc
的融合片段
P
trc
‑
rihC
分别连接到质粒
P2
中获得质粒
P3
‑
P5
；
(4)
将核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示的胞嘧啶脱氨酶基因
codA
与启动子
P

【专利技术属性】
技术研发人员：范晓光，刘欢，王倩倩，王昭颖，屈琰，刘亚琦，徐庆阳，陈宁，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：