一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，包括如下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法


[0001]本专利技术属于千金子遗传转化
，具体涉及一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法
。

技术介绍

[0002]我国
85
％以上的农田受杂草危害，造成每年粮食减产
3700
万吨
。
千金子
(Leptochloa chinensis)
是我国稻田的主要恶性杂草之一，其危害潜力仅此于稗草
。
当田间密度达到
21
株
/m2时，可使水稻减产
36
％以上
。
部分水稻直播田千金子危害严重，水稻收成减少大半，严重影响水稻的产量和质量
。
因此科学防控千金子对保障水稻优质增产具有重要意义
。2022
年
Molecule Plant
报道千金子染色体级别参考基因组的成功组装，这将有力推动有关千金子危害性的遗传与分子机制的调查研究
。
然而，千金子的遗传转化体系研究尚处于空白阶段，其相关基因的功能验证均无法在千金子体内进行研究，阻碍了千金子危害机制与安全防控的研究
。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，该方法以千金子愈伤为侵染材料，通过使用农杆菌
EHA105
侵染后能有效获得转基因千金子植株，为千金子功能基因的验证打下良好的基础，以及为千金子安全防控技术的研发提供了技术支撑
。
[0004]本专利技术的目的是通下述方式实现的：
[0005]一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，包括如下步骤：
[0006](1)
以千金子
(Leptochloa chinensis)
幼穗为外植体诱导产生胚性愈伤组织；
[0007](2)
用含有外源基因的农杆菌
EHA105
菌液侵染千金子愈伤组织后，置于共培养基中共培养；
[0008](3)
共培养结束后，将愈伤组织转入筛选培养基上进行筛选；
[0009](4)
将新产生的抗性愈伤组织转入分化培养基中培养；
[0010](5)
将分化培养得到的芽苗转到生根培基中分化出根；
[0011](6)
形成完整植株后炼苗移栽
。
[0012]步骤
(1)
在千金子孕穗初期，叶枕距为2～
5cm
长时，用剪刀剪下生长健壮的幼穗，在超净台用
0.1
％升汞消毒
15
分钟后用无菌水冲洗干净，无菌条件干燥后接种于诱导培养基进行暗培养，诱导后幼穗产生胚性愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织
。
[0013]步骤
(1)
中诱导和扩繁均优选是暗培养，且培养基配方和培养条件相同
。
[0014]步骤
(1)
愈伤组织诱导时，采用
4.43g/L M519
基础培养基
+0.5g/L
脯氨酸
+0.3g/L
水解酪蛋白
+0.5
～
4mg/L2
，4‑
D+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂，
pH
为
5.8
‑
5.9
，
26℃
‑
32℃
黑暗培养；
15
天产生愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织，时间
20
天左右
。
[0015]步骤
(2)
用
5.53g/L AAM
培养基
+30g/L
蔗糖
+100
‑
300
μ
mol/L AS(
乙酰丁香酮
),pH5.2
‑
5.6
的
AAM
侵染液将含有外源基因的农杆菌
EHA105
菌液调至
0D
600
为
0.3
～
1.0
，侵染千金子愈伤
10
‑
20min
后，进行共培养
。
[0016]步骤
(2)
浸染后的愈伤组织置于
5.53g/L AAM
培养基
+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂
+100
‑
300
μ
mol/L AS,pH5.2
‑
5.6
的共培养基中
21℃
‑
28℃
共培养2‑
4d。
[0017]本专利技术共培养为暗培养
。
[0018]步骤
(3)
共培养结束后，将愈伤转入
4.43g/L M519
基础培养基
+200
‑
400mg/L
特美汀
+30
‑
40mg/L
潮霉素
+0.5
～
4mg/L 2
，4‑
D+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂，
pH
为
5.8
‑
5.9
的筛选培养基上进行抗性筛选
。
[0019]步骤
(3)
中第一次抗性筛选后，
10
～
15d
转入新的筛选培养基上，进行第二次抗性筛选
。
[0020]本专利技术抗性筛选也是暗培养；筛选期间应时常监测污染情况，若有农杆菌侵染则及时剔除污染愈伤或及时转移未污染愈伤
。
[0021]步骤
(4)
将产生的抗性愈伤组织转入
4.43g/L M519
基础培养基
+100
‑
300mg/L
特美汀
+10
‑
30mg/L
潮霉素
+0.1
～
2.0mg/L 6
‑
BA+0
～
0.5mg/L KT+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂，
pH
为
5.8
‑
5.9
的分化培养基中，
26℃
‑
32℃,12h
光照
/12h
黑暗培养，光照强度为
8000
‑
20000Lx...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
以千金子
(Leptochloa chinensis)
幼穗为外植体诱导产生胚性愈伤组织；
(2)
用含有外源基因的农杆菌
EHA105
菌液侵染千金子愈伤组织后，置于共培养基中共培养；
(3)
共培养结束后，将愈伤组织转入筛选培养基上进行筛选；
(4)
将新产生的抗性愈伤组织转入分化培养基中培养；
(5)
将分化培养得到的芽苗转到生根培养基中分化出根；
(6)
形成完整植株后炼苗移栽
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
在千金子孕穗初期，叶枕距为2～
5cm
长时，用剪刀剪下生长健壮的幼穗，在超净台用
0.1
％升汞消毒
15
分钟后用无菌水冲洗干净，无菌条件干燥后接种于诱导培养基进行暗培养，诱导后幼穗产生胚性愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织
。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
愈伤组织诱导时，采用
4.43g/L M519
基础培养基
+0.5g/L
脯氨酸
+0.3g/L
水解酪蛋白
+0.5
～
4mg/L2
，4‑
D+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂，
pH
为
5.8
‑
5.9
，
26℃
‑
32℃
黑暗培养；
15
天产生愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织
。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
用
5.53g/L AAM
培养基
+30g/L
蔗糖
+100
‑
300
μ
mol/L AS,pH5.2
‑
5.6
的
AAM
侵染液将含有外源基因的农杆菌
EHA105
菌液调至
0D
600
为
0.3
～
1.0
，侵染千金子愈伤
10
‑
20min
后，进行共培养
。5.
根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤
(2)
浸染后的愈伤组织置于
5.53g/L AAM
培养基
+30g/L
蔗糖
+5g/L
植物凝胶或
8g/L
琼脂
+100
‑
300
μ
mol/L AS,pH5.2
‑
5.6
的共培养基中<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立峰，杨浩娜，柏连阳，陈玄，黄婷，唐易，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：