一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法技术

本发明专利技术提供一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法，包括准备菠菜材料

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法


[0001]本专利技术涉及一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法，涉及植物分子生物

。

技术介绍

[0002]菠菜
(Spinacia oleracea L.
，
2N
＝2×
＝
12)
是一种一年生或两年生的绿叶蔬菜，属于双子叶苋科
(Amaranthaceae)
植物
。
菠菜是一种重要的经济蔬菜作物，其含有大量的维生素
、
矿物质和抗氧化物质
。
在过去
20
年中，随着新鲜蔬菜市场的快速扩张，对菠菜的需求也在增加
。
通常，菠菜叶被用作沙拉中的新鲜蔬菜，或作为配料烹饪和蒸制
。
然而，在菠菜栽培过程中，易受到病原体等生物胁迫和盐
、
干旱和高温等非生物胁迫的威胁，严重影响其产量和品质
。
[0003]分子设计育种能够在一定程度上加快育种进程，是培育菠菜抗性品种的理想有效育种策略之一
。
然而，由于受到菠菜遗传转化体系不成熟的限制，很难深入开展菠菜基因功能及其调控通路研究
。
利用瞬时表达技术可以将目标基因导入到植物活体内，在短时间内
(
可长达数天
)
表达，能够准确反应基因的功能
。
因此，瞬时表达技术在启动子分析
、
蛋白互作，以及基因功能解析等方面被广泛应用/>。
瞬时表达系统可以克服稳定遗传转化系统再生效率低
、
组织培养程序复杂等不利因素，是开展基因功能研究的一种快速
、
方便和有效的基因表达方式
。
[0004]目前广泛应用的植物瞬时表达方法主要包括农杆菌渗透法
、
基因枪轰击法
、
聚乙二醇
(PEG)
介导的原生质体转化法；其中，基因枪轰击法对设备的要求较高，且每次得到的植物组织量少，难以满足后续分析的需要；原生质体转化法容易受到植物材料的限制，主要在拟南芥叶片
、
玉米原生质体及水稻悬浮细胞中应用
。
农杆菌渗透介导的瞬时表达系统具有操作简单
、
效率高的优点，已广泛应用于多种植物和不同组织的遗传转化
。
然而，瞬时表达方法的效率受到物种和实验条件的影响，不同物种所需要的最适实验条件不同
。
和菠菜同属于苋科且有瞬时表达方法报道的包括藜麦和甜菜
。
这两个物种虽然与菠菜都属于苋科，但是遗传关系相对较远，生物学特性也相差很大
。
因此，适用于藜麦和甜菜的瞬时转化方法无法直接应用于菠菜，目前仍然缺乏成熟的菠菜基因瞬时表达系统
。
菠菜叶片虽然相对容易进行注射，但是如何提高基因表达效率，即如何确定最优的瞬时表达条件，是本领域技术人员亟待解决的技术问题
。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法，基于菠菜自身的特点，进行实验条件的优化，确定了适用于菠菜的最优的瞬时表达条件，不仅可以提高转化效率，还可用于进行目标蛋白的亚细胞定位分析
、
蛋白相互作用研究等，为解析菠菜基因功能提供辅助手段
。
[0006]本专利技术提供一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法，包括如下步骤：
[0007]步骤
1、
准备菠菜材料：将菠菜种子放置在浸润无菌水的湿滤纸上，进行春化处理，并将春化处理后发芽的种子盆栽在土壤中进行生长，待菠菜幼苗生长到四片真叶期或六片真叶期时，准备进行后续试验；
[0008]步骤
2、
构建植物表达载体：将目的基因构建到植物表达载体上；
[0009]步骤
3、
准备农杆菌渗透液：将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌
GV3101(pSoup
‑
p19)
中，得到包括转化有目的基因的农杆菌渗透液；
[0010]步骤
4、
注射菠菜叶片：将所述农杆菌渗透液注射到步骤1获得的菠菜叶片中，直到注射叶片呈半透明状，并被所述农杆菌渗透液充满；
[0011]当菠菜生长至四片真叶期时，将农杆菌渗透液注射至第一对叶中；当菠菜生长至六片真叶期时，将农杆菌渗透液注射至第一对叶或第二对叶中；
[0012]步骤
5、
对注射好所述农杆菌渗透液的菠菜进行培养，并进行荧光检测，统计瞬时表达效率
。
[0013]进一步地，在黑暗遮光条件下对所述菠菜种子进行春化处理，所述春化处理的温度为
4℃
，时间为7天
。
[0014]进一步地，所述土壤包括珍珠岩
、
蛭石和泥炭土，且珍珠岩
、
蛭石和泥炭土的体积比为
1:2:2。
[0015]进一步地，步骤1中，将栽种在土壤中的菠菜放置在人工气候室中进行培养，所述人工气候室按照光照
10h/
黑暗
14h
的方式交替进行，控制光照温度为
22℃
，黑暗温度为
20℃
，相对湿度为
50
％
。
[0016]进一步地，所述植物表达载体为
pCAMBIA2300。
[0017]进一步地，将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌中，具体包括如下步骤：
[0018]通过热休克法将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌中，并培养获得单个阳性菌落；
[0019]对所述单个阳性菌落进行培养，待菌液的
OD600
为
0.6
～
0.8
时，停止培养，并离心收集菌体；
[0020]将所述菌体重悬于渗透溶液中稀释至
OD600
为
0.8
，得到农杆菌渗透液；
[0021]所述渗透溶液包括
1/2MS
培养基
、10mM MgCl2、10mM MES
·
H2O
和
200
μ
M
乙酰丁香酮
。
[0022]进一步地，所述方法还包括：待菠菜叶片被农杆菌渗透液充满后，用滤纸吸干菠菜叶片表面的农杆菌渗透液，将瞬时转化的菠菜叶在
20℃
的黑暗条件下培养
12h
，然后转移到正常光照培养条件继续培养
41
～
60h
；
[0023]所述正常光照培养条件按照光照
12h/
黑暗
10h
的方式交替进行，控制光照温度为
22℃
，黑暗的温度为
20℃。
[0024]进一步地，所述菠菜种子来源于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种农杆菌介导的菠菜瞬时表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤
1、
准备菠菜材料：将菠菜种子放置在浸润无菌水的湿滤纸上，进行春化处理，并将春化处理后发芽的种子盆栽在土壤中进行生长，待菠菜幼苗生长到四片真叶期或六片真叶期时，准备进行后续试验；步骤
2、
构建植物表达载体：将目的基因构建到植物表达载体上；步骤
3、
准备农杆菌渗透液：将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌
GV3101(pSoup
‑
p19)
中，得到包括转化有目的基因的农杆菌渗透液；步骤
4、
注射菠菜叶片：将所述农杆菌渗透液注射到步骤1获得的菠菜叶片中，直到注射叶片呈半透明状，并被所述农杆菌渗透液充满；当菠菜生长至四片真叶期时，将农杆菌渗透液注射至第一对叶中；当菠菜生长至六片真叶期时，将农杆菌渗透液注射至第一对叶或第二对叶中；步骤
5、
对注射好所述农杆菌渗透液的菠菜进行培养，并进行荧光检测，统计瞬时表达效率
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在黑暗遮光条件下对所述菠菜种子进行春化处理，所述春化处理的温度为
4℃
，时间为7天
。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述土壤包括珍珠岩
、
蛭石和泥炭土，且珍珠岩
、
蛭石和泥炭土的体积比为
1:2:2。4.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，将栽种在土壤中的菠菜放置在人工气候室中进行培养，所述人工气候室按照光照
10h/
黑暗
14h
的方式交替进行，控制光照温度为
22℃
，黑暗温度为
20℃
，相对湿度为
50
％
。5.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为
pCAMBIA2300。6.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌中，具体包括如下步骤：通过热休克法将含有目的基因的植物表达载体转化到农杆菌中，并培养获得单...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴绍军，孙美红，张雨萌，张咏雪，仇柳柳，王祎然，杨恩瑞，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：