【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及种子鉴定，具体涉及一种水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法。
技术介绍
1、自从在田间发现玉米单倍体诱导系以来，科学家就一直在探索玉米单倍体诱导系诱导单倍体产生的机制，如创制单倍体诱导系遗传群体，利用qtl分子技术将玉米单倍体诱导系诱导单倍体产生的相关基因进行粗和精细定位(deimling等，1997；等，1999；barret等，2008；x.dong等，2017)，随着基因组重测序技术的发展和测序成本的不断下调，在全基因组层面上对基因进行qtl分析成为可能(prigge等，2012)。最近国外和国内对玉米单倍体诱导系的研究证明玉米精子细胞特异表达的脂肪酶基因的插入片段突变是诱导系具有单倍体诱导功能的基础(timothy kelliher等，2017，chenxu liu等，2017)，而且脂肪酶基因在进化上相对保守(timothy kelliher等，2017)。这些研究对其它重要作物诱导系创制奠定了理论基础。
2、水稻crispr/cas9基因编辑技术和水稻转基因技术相对成熟，为水稻单倍体田间生产奠定了技术基础。
3、玉米诱导系诱导单倍体产生的分子机理的阐明，以及水稻中找到相关的同源基因，采用现代基因编辑技术编辑相关的基因，可以人为地创制水稻诱导系。
4、以水稻单倍体诱导系为父本，其它育种材料(一般是杂交后代f1)为母本，进行杂交，由于诱导系诱导产生单倍体种子是一个概率事件，后代种子有两种即单倍体种子和二倍体种子，由于单倍体种子和二倍体种子混杂在一起，很难从形态上区
5、由于单倍体植株是不育的即不能产生种子，必须把单倍体的染色体组加倍变成双单倍体才能产生种子。但是单倍体加倍成双单倍体一般需要在幼芽期进行。传统方法虽然能区分单倍体和二倍体植株，但是，却很难获得双单倍体植株和种子。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提出一种水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，能快速筛选出水稻单倍体种子，筛选过程简单高效，可操作性强，相对传统方法成本低，为单倍体加倍成双单倍体的后续工作提供基础。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、本专利技术提供一种水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，包括以下步骤：
4、s1.种子糊粉层特异表达红色荧光蛋白载体，通过ecor1和kpn1连接荧光基因；
5、s2.选米、脱米、洗米、摆米、拔米；
6、s3.lb菌板的倒置；
7、s4.挑选愈伤组织，将愈伤组织浸泡在菌体均匀的悬浮的sus悬浮液中，取出，吹干，晾置，倒置co培养基上暗培养，然后清洗愈伤组织；
8、s5.将愈伤组织放置于一筛培养基上，暗培养，一筛换板，然后进行二次换板，继续暗培养，挑出，干燥；
9、s6.将干燥好的愈伤组织挑到对应的分化培养基上，光照培养，换板，生根，取样检测，获得转基因水稻单倍体诱导系；
10、s7.将获得的转基因水稻单倍体诱导系和其它育种材料杂交产生种子，通过肉眼观察种子种皮的颜色，筛除二倍体种子，对于带有相似颜色的其它育种材料，用荧光观察镜观察种子颜色，筛除具有红色荧光的二倍体种子。
11、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述荧光基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12、作为本专利技术的进一步改进，步骤s1中所述荧光基因表达的荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13、作为本专利技术的进一步改进，步骤s2中所述洗米依次用的75％酒精、30％次氯酸钠溶液、0.15％氯化汞溶液洗涤。
14、作为本专利技术的进一步改进，所述75％酒精的配方为无水乙醇375ml+125ml纯水；所述30％次氯酸钠溶液的配方为50μl曲拉通+150ml次氯酸钠溶液+350ml纯水；所述0.15％氯化汞溶液的配方为0.75g氯化汞+500ml纯水。
15、作为本专利技术的进一步改进，步骤s2中拔米的过程为：将米粒和芽分离开，拔之前把两把镊子烧好，拔米时不让两把镊子相互接触，有菌的和没有菌的分开拔，拔好有菌的愈伤组织要在培养基上面做好记号，长芽上结或愈伤组织质量差的不拔，拔愈伤组织质量好的，每一颗愈伤组织均匀的帖在培养基上摆放，每板愈伤组织摆放60到70颗。
16、作为本专利技术的进一步改进，步骤s3中lb菌板倒置方法如下：
17、(1)将灭好的lb菌液摇晃均匀，放置到能用手触摸，但温度要在55-65c°之间；
18、(2)将一次性细菌培养皿60mm，每升lb培养基加入药品对应as、kana、rif，比例1：1，药品摇晃均匀后倒入一次性细菌培养皿中，到2/3；所述as的浓度为1000-2000μl/l，所述kana的浓度为30-70mg/l，rif的浓度为30-70mg/l；
19、(3)倒完放置晾干，保鲜膜封口冷藏保存。
20、作为本专利技术的进一步改进，所述通过转基因技术获得转基因水稻单倍体诱导系的具体方法如下：采用粗提法制备样品模板，pcr扩增，种子糊粉层特异表达红色荧光蛋白载体pcambia1300，通过ecor1和kpn1把荧光基因连接上去，得到转荧光蛋白基因载体。
21、作为本专利技术的进一步改进，所述pcr体系如下：2×tegn taq mix 15-25μl，前引物0.5-1.5μl，后引物0.5-1.5μl，模板dna1-3μl，ddh2o补足至40μl；所述pcr反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s，退火55-60℃，30s，延伸72℃，根据片段长度确定时间，每1kb/min，35-40循环；终延伸72℃，4min。
22、本专利技术具有如下有益效果：
23、本专利技术以水稻单倍体诱导系为出发材料，应用现代转基因技术获得红色荧光蛋白基因种子特异表达的转基因水稻单倍体诱导系。转基因水稻单倍体诱导系和其它育种材料杂交产生的种子具有红色种皮可以作为筛选单倍体种子的一个标记。对于带有相似颜色的其它育种材料，荧光观察镜下转基因水稻单倍体诱导系和其它育种材料杂交产生的种子具有红色荧光可以作为筛选单倍体种子的一个标记。
24、本专利技术具有如下优点：
25、(1)能快速筛选出水稻单倍体种子。
26、(2)筛选过程简单高效，可操作性强。
27、(3)相对传统方法成本低。
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1.一种水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述荧光基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述荧光基因表达的荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S1中所述载体为pcambia1300。
5.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S2中所述洗米依次用的75％酒精、30％次氯酸钠溶液、0.15％氯化汞溶液洗涤。
6.根据权利要求2所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，所述75％酒精的配方为无水乙醇375ml+125ml纯水；所述30％次氯酸钠溶液的配方为50μL曲拉通+150ml次氯酸钠溶液+350ml纯水；所述0.15％氯化汞溶液的配方
7.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S2中拔米的过程为：将米粒和芽分离开，拔之前把两把镊子烧好，拔米时不让两把镊子相互接触，有菌的和没有菌的分开拔，拔好有菌的愈伤组织要在培养基上面做好记号，长芽上结或愈伤组织质量差的不拔，拔愈伤组织质量好的，每一颗愈伤组织均匀的帖在培养基上摆放，每板愈伤组织摆放60到70颗。
8.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤S3中LB菌板倒置方法如下：
9.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，所述转基因水稻单倍体诱导系的具体方法如下：采用粗提法制备样品模板，PCR扩增，种子糊粉层特异表达红色荧光蛋白载体pcambia1300，通过ECOR1和KPN1把荧光基因连接上去，获得转荧光基因载体。
10.根据权利要求6所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，所述PCR体系如下：2×Tegn Taq Mix 15-25μl，前引物0.5-1.5μl，后引物0.5-1.5μl，模板DNA 1-3μl，ddH2O补足至40μl；所述PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性95℃，30s，退火55-60℃，30s，延伸72℃，根据片段长度确定时间，每1kb/min，35-40循环；终延伸72℃，4min。
...【技术特征摘要】
1.一种水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述荧光基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述荧光基因表达的荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤s1中所述载体为pcambia1300。
5.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤s2中所述洗米依次用的75％酒精、30％次氯酸钠溶液、0.15％氯化汞溶液洗涤。
6.根据权利要求2所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，所述75％酒精的配方为无水乙醇375ml+125ml纯水；所述30％次氯酸钠溶液的配方为50μl曲拉通+150ml次氯酸钠溶液+350ml纯水；所述0.15％氯化汞溶液的配方为0.75g氯化汞+500ml纯水。
7.根据权利要求1所述水稻单倍体诱导系诱导产生的单倍体种子鉴定方法，其特征在于，步骤s2中拔...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄安平，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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