一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法及应用。本发明专利技术方法采用脂质体包裹dsRNA，再导入草地贪夜蛾，本发明专利技术的脂质体包裹dsRNA的RNAi后，能够有效的传递dsRNA进入草地贪夜蛾体内，干扰效果显著，能够满足草地贪夜蛾体内基因的功能研究。且制备方法简单快速，具有实际应用价值。具有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法和应用。

技术介绍

[0002]目前害虫的RNAi的方法主要包括转基因介导法、微量注射法、饲喂法等。转基因植物介导法周期长，难度较大，干扰效果不明显。微量注射法成本高，操作系数大、很难在田间进行大规模应用。饲喂法是直接在体外合成dsRNA，将dsRNA配置成溶液直接饲喂害虫，但是dsRNA在体外易降解，特别是鳞翅目昆虫肠道含有大量核酸降解酶极易降解dsRNA,从而影响干扰效果。纳米粒子近十几年被广泛用于RNAi，能够保护dsRNA不被昆虫消化道的各种酶降解。
[0003]脂质体（Liposomes）由Bangham等人提出，现在普遍指将磷脂等类脂质分散于水中所形成的具有双分子层包裹水相结构的封闭小囊泡，由于脂质体与细胞磷脂结构的生物相容性，以脂质体对 dsRNA 进行包被能够提高细胞对dsRNA 的吸收效率，并且具有极好的生物相容性。
[0004]目前利用各种外界材料提升草地贪夜蛾RNAi效应报道较少，效果不明显，更多的应用集中在使用昆虫细胞中，对活体昆虫的研究尚无具体定论。因此挖掘利用提升草地贪夜蛾RNAi效率的组合材料，对于利用RNAi的草地贪夜蛾害虫防控具有十分重要的意义。本专利技术首次在鳞翅目昆虫中报道了一种可以提升昆虫RNAi效率的方法，且该组合简单易制备，并且能够使得对应的dsRNA在脂质体包裹下在草地贪夜蛾中稳定传递并吸收。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种用于草地贪夜蛾的RNAi的纳米颗粒方法和用途，此种dsRNA的纳米颗粒可以更加稳定的在草地贪夜蛾体内传递和吸收，满足草地贪夜蛾特定基因的干扰。
[0006]本专利技术提供一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法，其采用脂质体包裹dsRNA，再导入草地贪夜蛾。
[0007]优选地，所述dsRNA与Lipofetamine2000混合实现脂质体包裹dsRNA。
[0008]更具体地，将Lipofetamine2000溶于RNase
‑
free water混匀，室温静置3
‑
8min；再将所述dsRNA 与其混匀，最终得到复合物，放置冰上待用。
[0009]优选地，所述复合物现配现用。
[0010]更具体地，Lipofetamine2000购买自Thremo公司，使用时稀释100
‑
300倍，优选为200倍；dsRNA 使用的终浓度为100
‑
200 ng/ul ，优选为150ng/ul。
[0011]在具体实施方式中，所述dsRNA是针对V
‑
ATPase基因。
[0012]更具体的，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0013]本专利技术的一个具体实施方式中：将1
µ
l Lipofetamine2000溶于100
ꢀµ
l RNase
‑
free water混匀，室温静置5min；将10
µ
l dsRNA加至90
ꢀµ
l RNase
‑
free water中，最后将稀
释过后的dsRNA和Lipofetamine 2000混匀，放置冰上待用。
[0014]本专利技术提供所述的方法在草地贪夜蛾进行干扰中的应用。具体地，采用所述的复合物饲喂草地贪夜蛾幼虫，优选地连续饲喂一周。
[0015]本专利技术具有以下优点：本专利技术的脂质体包裹dsRNA的RNAi后，能够有效的传递dsRNA进入草地贪夜蛾体内，干扰效果显著，能够满足草地贪夜蛾体内基因的功能研究。且制备方法简单快速，具有实际应用价值。
[0016]附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0018]图1是本专利技术实施例4中提取的V
‑
ATPase基因的dsRNA的凝胶电泳图。
[0019]图2是本专利技术效果例中草地贪夜蛾幼虫生长量的柱形图。
[0020]图3是本专利技术效果例中草地贪夜蛾幼虫死亡率的柱形图。
[0021]图4是本专利技术效果例中qRT
‑
PCR测定V
‑
ATPase基因相对表达量的柱形图。
[0022]具体实施方式
[0023]下列实施例中提供的材料、试剂均为市售产品，包括不限于Trizol Reagent (Magen),HiScript
®Ⅱꢀ
Q RT SuperMix for Qpcr(+gDNA wiper) reagent Kit(Perfect Real time)( Vazyme), Premix Taq
™ꢀ
(TaKaRa), E.Z.N.A. Gel Extraction Kit（Omega）,T7 RiboMAX
™ꢀ
Express RNAi System (Promega), Lipofetamine2000 (Thermo Fisher Science), RNase
‑
free water ( Vazyme)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix ( Vazyme)，pMD 19
‑
T Vector(TaKaRa)以上采用不同的厂家和型号不会对专利技术技术方案所产生的技术效果产生显著的差异。
[0024]实施例1 草地贪夜蛾总RNA提取提取草地贪夜蛾全身的RNA采用Trizol提取法，操作按照MagZol Reagent说明书进行。提取的RNA用多功能酶标仪检测浓度，使用1%的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，电泳检测RNA质量。
[0025]实施例2 草地贪夜蛾cDNA的合成在获得草地贪夜蛾总RNA之后，采用HiScript
®Ⅱꢀ
Q RT SuperMix for Qpcr(+gDNA wiper) reagent Kit(Perfect Real time)进行cDNA的合成，具体操作步骤参照说明书。总RNA和cDNA分别保存于
‑
80℃和
‑
20℃。
[0026]实施例3 目的基因的扩增应用Primer5软件设计基因V
‑
ATPase的特异性引物，引物序列见表1，使用Premix Taq
™ꢀ
(TaKaRa Taq
™ꢀ
Version 2.0)进行扩增，反应体系如表2所示，产物大小为528bp，使用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit对扩增产物进行纯化回收，具体操作参考试剂说明书，将纯化产物连接至pMD 19
‑
T Vector，具体操作参照试剂说明书。转化，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高草地贪夜蛾RNAi效率的方法，其特征在于，采用脂质体包裹dsRNA，再导入草地贪夜蛾。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dsRNA与Lipofetamine2000混合实现脂质体包裹dsRNA。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将Lipofetamine2000溶于RNase
‑
free water混匀，室温静置3
‑
8min；再将所述dsRNA 与其混匀，最终得到复合物，放置冰上待用。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述复合物现配现用。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，Lipofeta...

【专利技术属性】
技术研发人员：方勇，王锦达，朱菲莹，王然，梁沛，陈红松，潘求一，王俊华，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：