一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖技术

本发明专利技术属于生物技术和遗传育种技术领域，具体公开了一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖

【技术实现步骤摘要】
一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和遗传育种
，特别是一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖
、
酸含量降低的番茄植株中的应用
。

技术介绍

[0002]番茄的果实品质由外观品质
、
风味品质
、
营养品质和加工贮藏品质构成
。
其中，番茄的风味物质主要指果实中溶于水并且能被味觉器官所感知到的呈味物质的总称，番茄果实中风味物质主要包含可溶性糖
、
有机酸
、
游离氨基酸等，它们分别是果实甜味
、
酸味以及鲜味的来源
。
由于番茄的品种不一样，他们原始的酸度就是不一样，有些他的原本的口感就是酸的，就像圣女果一样，他口感特别的好，但是有些太甜了，像是一些糖尿病病人不能吃
。
[0003]番茄果实中的可溶性糖主要包含葡萄糖
、
果糖和蔗糖，其中蔗糖含量很低；而有机酸酸主要包括柠檬酸
、
苹果酸
、
酒石酸
、
草酸，以柠檬酸和苹果酸为主
。
[0004]氨基酸渗透酶
(AAPs)
是植物中存在的转运氨基酸的蛋白家族，在植物吸收转运氨基酸和品质形成中发挥重要作用
。
水稻中氨基酸渗透酶
OsAAP6
通过改变的氨基酸含量正向调控籽粒蛋白含量，而
OsAAP5
的下调表达降低了碱性氨基酸和中性氨基酸的含量，从而维持较高的细胞分裂素水平，调控水稻分蘖数，增加水稻产量
。
氨基酸能够合成植物细胞物质，节省植株自身的热能和光合作用物质，促进碳
、
氮代谢进程，提高光合作用，进而影响果实中的糖
、
酸代谢
。
[0005]因此，有必要开发降低果实糖
、
酸含量的番茄植株
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖
、
酸含量降低的番茄植株中的应用
。
[0007]为达到上述目的，本专利技术是按照以下技术方案实施的：
[0008]本专利技术的第一个目的是要提供一种重组质粒的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1、
提取番茄
RNA
，并反转录
cDNA
，利用设计的如
SEQ ID NO.1
所示的上游引物和如
SEQ ID NO.2
所示的下游引物以
cDNA
为模板进行扩增，获得番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段；
[0010]S2、
将番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段构建入
pTRV2
载体中，得到重组质粒
pTRV2
‑
AAP7。
[0011]进一步地，所述番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段的大小为
300bp
，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0012]进一步地，所述步骤
S1
中，扩增番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段的反应体系为：高保真
DNA
聚合酶
25
μ
L
，上游引物
F 2
μ
L
，下游引物
R 2
μ
L
，
cDNA 1
μ
L
，
RNase
‑
Free ddH2O 20
μ
L
；反应程序
:98℃5min
；
98℃30s,56℃30s
，
72℃60s
，
35
个循环；
4℃∞。
[0031]质粒载体及重组农杆菌的构建
[0032]1、
提取番茄
RNA
，使用康为世纪试剂盒，具体步骤为：
[0033]1)
样品处理：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在
TRizon Reagent
中迅速研磨，每
30
‑
50mg
组织中加入
1ml TRizon Reagent
，混匀
。
[0034]2)
样品中加入
TRizon Reagent
后反复吹打几次，使样品充分裂解
。
室温放置五分钟，使蛋白核酸复合物完全分离
。
[0035]3)
以每
1ml TRizon Reagent
加入
200
μ
L
氯仿，盖好管盖，剧烈震荡
15s
，室温放置
2min。
[0036]4)4℃12000rpm
离心
10min
，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，
RNA
主要在上层水相，将上层水相移到一个新的
DNase
‑
Free
离心管中
。
[0037]5)
在得到的水相溶液中加入等体积的
70
％乙醇，颠倒混匀
。
[0038]6)
将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入
。12000rpm
离心
20s
，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中
。
[0039]7)
向吸附柱中加入
700
μ
L RW1
，
12000rpm
离心
20s
，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中
。
[0040]8)
向吸附柱中加入
500
μ
L RW2
，
12000rpm
离心
20s
，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中
。
[0041]9)
重复步骤
8)。
[0042]10)12000rpm
离心
2min
，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干
。
[0043]11)
将吸附柱置于一个新的无
RNase
离心管中，向吸附柱的中间部位加入
30
‑
50
μ
L RNase
‑
Free Water
，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
提取番茄
RNA
，并反转录
cDNA
，利用设计的如
SEQ ID NO.1
所示的上游引物和如
SEQ ID NO.2
所示的下游引物以
cDNA
为模板进行扩增，获得番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段；
S2、
将番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段构建入
pTRV2
载体中，得到重组质粒
pTRV2
‑
AAP7。2.
根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段的大小为
300bp
，核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。3.
根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤
S1
中，扩增番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段的反应体系为：高保真
DNA
聚合酶
25
μ
L ，上游引物
F 2
μ
L
，下游引物
R 2
μ
L
，
cDNA 1
μ
L
，
RNase
‑
Free ddH2O 20
μ
L
；反应程序
:98℃ 5min
；
98℃ 30s, 56℃ 30s
，
72℃ 60s
，
35
个循环；
4℃ ∞。4.
根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，将番茄
SlAAP7
基因特异性目的片段与双酶切后的终载
pTRV2
质粒进...

【专利技术属性】
技术研发人员：许涛，张鹤洋，成丽娜，李瑞祯，刘显凤，贺子昊，刘洋，李天来，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：