一种酶联免疫吸附检测方法技术

本发明专利技术在

【技术实现步骤摘要】
一种酶联免疫吸附检测方法、试剂盒、使用方法及其应用


[0001]本专利技术涉及酶联免疫检测
，具体涉及一种酶联免疫吸附检测方法
、
试剂盒
、
使用方法及其应用
。

技术介绍

[0002]酶联免疫吸附测定
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay
，
ELISA)
指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法
。
传统
ELISA
技术包括直接法
、
间接法
、
双抗体夹心法和竞争法
。
其中夹心法或间接法是当前广泛使用的
ELISA
技术
。
该技术需要经过两步，甚至三步操作来达到孵育目的
。
操作复杂，且检测时间长
。
[0003]随着需求不断变化，夹心法或间接法也不断更新迭代，从三步孵育法到两步孵育法，再到一步孵育法，最终优化为一步法
。
如专利申请
CN116087503A
公开了一种实现
ELISA
简易操作的方法，其将捕获抗体包被在酶标板底部，将
HRP
酶和检测抗体制成冻干微球后预先放置在酶标板内，使用时，将稀释后的样品加入样本孔内进行孵育，再进行显色反应即可实现检测，该现有技术将
TMB
显色之前的操作整合为一步，一次孵育抗体后也只需洗涤操作一次即可，简化了检测步骤，减少了检测时间，然而，该现有技术仍然存在需要将
HRP
酶和检测抗体制备成冻干微球
、
不利于大规模生产的问题，且其检测时间至少需要
90
分钟
。

技术实现思路

[0004]（一）要解决的技术问题现有技术一步
ELISA
方法中
HRP
酶和检测抗体制备成冻干微球
、
不利于大规模生产的问题
。
[0005]（二）技术方案为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种酶联免疫吸附检测方法，所述方法包括：（1）将捕获抗体固定在酶联反应板上；（2）用蛋白保护剂分别稀释
HRP
酶标抗原与流动性捕获抗体，制备成混合液；（3）稀释样本；（4）将所述稀释后的样本与所述混合液加入所述酶联反应板的反应孔中，进行孵育；（5）洗涤后，加入底物进行孵育；（6）加终止液，读取显示结果
。
[0006]进一步地，所述步骤（1）具体包括将捕获抗体用包被液稀释后加入到酶联反应板中，去除孔内液体后进行洗涤，洗涤后去除孔内液体并拍干，加入封闭液进行封闭
。
[0007]进一步地，所述步骤（1）中的酶联反应板为高结合力酶标板，使用亲水角测量仪进行测试，微孔水平底部的亲水角
θ
≥120
ꢀº
。
[0008]进一步地，所述步骤（1）中的捕获抗体为多克隆抗体，种属与靶标抗体存在较大的
差异性，为羊抗鼠多克隆抗体或羊抗兔多克隆抗体其中的一种
。
[0009]进一步地，所述步骤（2）具体包括用蛋白保护剂分别将
HRP
酶标抗原与流动性捕获抗体分别稀释
40000
倍与
10000
倍，制备成
HRP
与流动性捕获抗体混合液
。
[0010]进一步地，所述步骤（2）中蛋白保护剂包括糖
、
无关蛋白
、
表面活性剂
、
防腐剂
、
金属离子及还原剂
。
[0011]进一步地，
1000mL
蛋白保护剂包含：氯化钾
0.2g
，氯化钠
8.00g
，磷酸二氢钾
0.2g
，磷酸氢二钠
2.9g
，优级胎牛血清
100mL
，
Proclin 300 0.5mL
，
Triton
™ꢀ
X
‑
100 0.5mL
，
2%
鱼皮明胶，
0.05%
聚乙烯吡咯烷酮
K30
（
PVP30
），
1%
ꢀ‑
5%BSA
，
0.2%
‑
1% Casein
，
2%
‑
5%
海藻糖，
0.095g Mgcl2
，
0.721g DDT。
[0012]进一步地，
1000mL
蛋白保护剂包含：氯化钾
0.2g
，氯化钠
8.00g
，磷酸二氢钾
0.2g
，磷酸氢二钠
2.9g
，优级胎牛血清
100mL
，
Proclin 300 0.5mL
，
Triton
™ꢀ
X
‑
100 0.5mL
，
2%
鱼皮明胶，
0.05%
聚乙烯吡咯烷酮
K30
（
PVP30
），
1% BSA
，
0.2%Casein
，
2%
海藻糖，
0.095g Mgcl2
，
0.721g DDT。
[0013]所述蛋白保护剂能够有效提高检测试剂的稳定性，其中，（1）糖的作用：作为保护剂的糖类，其保护作用与它们的化学结构有密切关系
。
它们通常具有5个以上的羟基，可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的
。
海藻糖是一种稳定的非还原性双糖
。
海藻糖的羟基也能代替水分子同蛋白质分子表面部分结合，对蛋白质形成保护
。
同时海藻糖的分子较小，易于以分子的形式填充到蛋白质分子的空隙中，有效限制蛋白质分子内部的结构发生变化
。
从而能避免变性失活
。
[0014]2）无关蛋白的作用：当蛋白的浓度很低时，一般低于
0.05mg/mL
，蛋白会变得不稳定，当加入一定量的无关蛋白，比如
BSA
与
Casein
联用，可以增加蛋白质整体浓度水平，进而增加蛋白的稳定性
。
[0015]3）表面活性剂的作用蛋白质在液体环境下，容易发生分子之间的碰撞，随着时间的增加，这种热力学的势能会进一步增加蛋白质结构的不稳定性
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）将捕获抗体固定在酶联反应板上；（2）用蛋白保护剂分别稀释
HRP
酶标抗原与流动性捕获抗体，制备成混合液；（3）稀释样本；（4）将所述稀释后的样本与所述混合液加入所述酶联反应板的反应孔中，进行孵育；（5）洗涤后，加入底物进行孵育；（6）加终止液，读取显示结果
。2. 根据权利要求1所述的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中
1000mL
蛋白保护剂包括：氯化钾
0.2g
，氯化钠
8.00g
，磷酸二氢钾
0.2g
，磷酸氢二钠
2.9g
，优级胎牛血清
100mL
，
Proclin 300 0.5mL
，
Triton
™ꢀ
X
‑
100 0.5mL
，
2%
鱼皮明胶，
0.05%
聚乙烯吡咯烷酮
K30
，
1%
ꢀ‑
5%BSA
，
0.2%
‑
1% Casein
，
2%
‑
5%
海藻糖，
0.095g Mgcl2
，
0.721g DDT。3. 根据权利要求2所述的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中
1000mL
蛋白保护剂包括：氯化钾
0.2g
，氯化钠
8.00g
，磷酸二氢钾
0.2g
，磷酸氢二钠
2.9g
，优级胎牛血清
100mL
，
Proclin 300 0.5mL
，
Triton
™ꢀ
X
‑
100 0.5mL
，
2%
鱼皮明胶，
0.05%
聚乙烯吡咯烷酮
K30
，
1% BSA
，
0.2%Casein
，
2%
海藻糖，
0.095g Mgcl2
，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世成，杨忠苹，赵和平，
申请(专利权)人：湖南冠牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：