PCR反应体系、试剂盒和PCR方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种PCR反应体系、试剂盒和PCR方法。所述PCR试剂包括KOH、SDS、精氨酸、Brij

【技术实现步骤摘要】
PCR反应体系、试剂盒和PCR方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种PCR反应体系、试剂盒和PCR方法。

技术介绍

[0002]目前主流的免提取/快速提取qPCR方法主要包括蛋白变性方法和蛋白分离方法，蛋白变性方法往往和蛋白分离方法组合使用。蛋白变性方法包括水煮法、碱裂解法和蛋白酶法。蛋白分离方法包括鳌合树脂、有机沉淀、超滤方法和SDS
‑
K
+
法。然而这些方法具有各种缺陷，例如水煮法存在需要加热，容易污染，且不能提取RNA，或对RNA灵敏度不够等问题；破裂解法存在不足以裂解蛋白等问题；蛋白酶法存在消化完需要分离，否则会消化Taq酶等问题。鳌合树脂法存在Chelex
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100不溶于水，生产不便，且必须搭配水煮法使用等问题；有机试剂法存在试剂毒性较大等问题；超滤方法的成本高，且通常还需要热缩管或离心机。SDS
‑
K
+
法则会有较多的基因组损失。
[0003]目前免提取/快速提取qPCR方法还包括耐抑制酶法，但该方法需要特殊的酶，成本较高，而且通常一种突变酶只会耐受某些种类的抑制剂，对另外一些抑制剂不会有作用；且另一些耐抑制剂酶(截短的Taq—Stoffel片段)失去5
‑
3外切活性，仅能用于普通PCR，无法进行荧光PCR。因此亟需专利技术一种新的提取/快速提取qPCR的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于专利技术一种新的将PCR成分前置免提取扩增DNA的方法。
[0005]具体的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]本专利技术第一个方面公开了一种PCR试剂，所述PCR试剂包括KOH、SDS、精氨酸、Brij
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35、TritonX
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100、尿素和DTT。
[0007]优选的，所述KOH的浓度为0.5
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2M；
[0008]优选的，所述精氨酸的浓度为25
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40mM；优选的，所述DTT的浓度为18
‑
40mM；优选的，所述尿素的浓度为1
‑
2M。
[0009]优选的，所述PCR试剂包括0.5
‑
2M KOH、(5
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15)％SDS、25
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40mM精氨酸、(1
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5)％Brij
‑
35、(1
‑
5)％TritonX
‑
100、1
‑
2M尿素和18
‑
40mM DTT。
[0010]本专利技术第二个方面公开了一种PCR反应体系，所述PCR反应体系包括上述的PCR试剂。
[0011]优选的，所述PCR反应体系还包括盐、dNTPs和Taq酶。
[0012]更优选的，所述PCR反应体系还包括引物和荧光探针。
[0013]优选的，所述PCR反应体系中，KOH的终浓度为40
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60mM；优选的，精氨酸的终浓度为0.5
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2mM；优选的，所述尿素的终浓度为60
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90mM；优选的，所述DTT的终浓度为0.5
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2mM。
[0014]本专利技术第三个方面公开了一种包含上述PCR反应体系的产品；优选的，所述产品为试剂盒。
[0015]本专利技术第四个方面公开了一种PCR方法，所述方法包括使用上述的PCR试剂或上述
的PCR反应体系进行反应，或使用上述的产品进行反应。
[0016]优选的，先将PCR试剂加入到样品中进行前置处理，然后再将PCR反应体系加入样品中继续处理，接着进行PCR反应；
[0017]优选的，所述样品为全血样品。
[0018]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本专利技术的构思与保护范围。
[0019]PCR中的一些添加剂对抑制剂有去除作用，当这些添加剂浓度较低时，不会抑制Taq酶，但对样本中的杂质也没有去除效果；当这些添加剂浓度较高时，会抑制Taq酶，同时也可以去除样本中的杂质。由此，本专利技术创新性的将PCR试剂的一部分成分以高浓度提前加入以处理样本，之后和处理后的样本同步稀释，以直接进行PCR。
[0020]本专利技术的方法中，通过稀释比例提高核酸纯度，同时由于不引入额外的胍盐、乙醇、异丙醇、Na+等抑制剂，所有成分浓度经测试均不会抑制PCR。
[0021]所述添加剂还包括精氨酸，精氨酸是一种含有胍基的氨基酸，呈强碱性，具有一定的裂解作用。
[0022]所述添加剂还包括SDS，SDS由于其对PCR的强抑制性，通常用于裂解液，而不会被用于PCR，本专利技术使用低浓度的SDS，确保其终浓度不超过0.005％。
[0023]通常PCR的主要成分包括Tris，K+(通常是KCl或KOAc)。本专利技术首次将K+用KOH的形式前置，在提供同等浓度K+的同时，使用碱裂解的方式对样本中的病毒或细菌进行裂解，同时也使样本中的蛋白类抑制剂变性失活。
[0024]本专利技术中将PCR中的这些成分等比例提高浓度，用于先行对样本进行提取，而后配制成反应液后稀释到普通PCR浓度。
[0025]本专利技术相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
[0026](1)不在PCR体系中额外引入任何抑制PCR扩增的成分，包括胍盐、乙醇、异丙醇等。
[0027](2)PCR核心组分前置，如果样本没有经过处理，无法扩增。例如典型的以气溶胶形式存在的质粒、PCR产物并不会获得扩增。
[0028](3)利用本专利技术的方法扩增DNA，在前处理阶段无需对样本进行加热、离心处理，操作非常简便。
附图说明
[0029]图1为实施例1的实验结果图；
[0030]图2为实施例2的实验结果图；
[0031]图3为实施例3的实验结果图；
[0032]图4为实施例4的实验结果图(图中A为实验组，B为对照组1，C为对照组2)
具体实施方式
[0033]下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案进行详细描述，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。
[0034]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0035]实施例1：
[0036]本实施例包含实验组和对照组实验。
[0037]一、实验组实验：
[0038]将2000IU/ml的HCMV血清(广州邦德盛生物BDS
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BW
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003，用阴性牛血清稀释120倍制备)加入9倍体积的如下表1所示的稀释液中，混匀后静置10min。
[0039]表1
[0040][0041][0042]取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Direct PCR buffer，4U Taq酶，0.4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR试剂，其特征在于，所述PCR试剂包括KOH、SDS、精氨酸、Brij
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35、TritonX
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100、尿素和DTT。2.根据权利要求1所述的PCR试剂，其特征在于，所述KOH的浓度为0.5
‑
2M；优选的，所述精氨酸的浓度为25
‑
40mM；优选的，所述DTT的浓度为18
‑
40mM；优选的，所述尿素的浓度为1
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2M。3.根据权利要求1所述的PCR试剂，其特征在于，所述PCR试剂包括0.5
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2M KOH、(5
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15)％SDS、25
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40mM精氨酸、(1
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5)％Brij
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35、(1
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5)％TritonX
‑
100、1
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2M尿素和18
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40mM DTT。4.一种PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨忠苹，赵和平，杨德全，廖娟红，王涛，
申请(专利权)人：湖南冠牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：