适配体筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了适配体筛选方法及其应用。该方法可用于筛选与小分子结合的适配体。本发明专利技术的筛选方法可以解决目前SELEX技术所存在的实验设计困难、筛选流程复杂等问题，更重要的是，运用此方法可以筛选得到的RNA适配体一方面是适体酶，另一方面又是人工核糖开关，可以应用于基因的5

【技术实现步骤摘要】
适配体筛选方法及其应用


[0001]本专利技术属于分析检测
，具体涉及适配体及筛选方法。

技术介绍

[0002]目前适配体主要是由一种名为“SELEX”的体外筛选技术而得到。传统的SELEX技术是以合成的随机DNA文库开始的，其筛选过程十分繁琐，耗时较长。随后，各种新的SELEX技术随之被开发出来，例如：对于大分子分离有效的硝酸纤维素膜过滤的SELEX、基因组SELEX(Genomic SELEX)、small RNA transcriptomic SELEX(smaRt
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SELEX)、Capture
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SELEX等，这些改良技术使SELEX的应用更为广泛。但遗憾的是目前存在的SELEX技术仍然存在实验设计困难、筛选流程复杂等问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了适配体筛选方法及其应用。
[0004]本专利技术的目的一方面，是解决现有的SELEX技术存在的问题，提出一种全新的适配体筛选方法，将工具酶中不影响剪切位点的原始序列替换为随机序列，使得工具酶结构被破坏不能发生剪切，由此构建文库；加入目标分子后，目标分子与随机序列结合并发生构象改变，使工具酶恢复完整结构并发生自我剪切；以工具酶发生剪切作为过滤筛选条件，进而通过若干轮筛选富集，得到可与目标分子结合的适配体。
[0005]一实施例中，所述工具酶包括核酶或DNA酶中的至少一种。
[0006]优选地，所述核酶包括锤头状核酶(Hammerhead Ribozyme，HHR)。
[0007]一实施例中，所述目标分子包括L
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别异亮氨酸。
[0008]进一步地，在以锤头状核酶HHR为工具酶、以L
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别异亮氨酸为目标分子的情况下，本专利技术实质提供了一种新的RNA适配体筛选方法，此筛选方法将核酶发生剪切作为过滤筛选条件，将Hammerhead Ribozyme(HHR)的茎Ⅱ全部替换成70个随机碱基，此时核酶结构被打破不能发生剪切。通过将整个RNA文库固定于链霉亲和素磁珠(Beads)上，目标分子(L
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别异亮氨酸)加入后，随机序列发生折叠，帮助核酶恢复完整结构，核酶可以发生自我剪切。经过几轮筛选富集得到与L
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别异亮氨酸结合的适配体。
[0009]具体地，所述适配体筛选方法包括以下步骤：
[0010]步骤一，以锤头状核酶HHR的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列作为模板建立DNA文库后，转录为所需要的RNA文库；
[0011]步骤二，固定RNA文库于磁珠上；
[0012]步骤三，加入目标分子并孵育，经过筛选富集得到与目标分子结合的适配体；
[0013]步骤四，测序得到适配体的序列。
[0014]更具体地，所述步骤一包括：
[0015]1)构建DNA文库：取锤头状核酶HHR的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列SEQ ID No:01作为模板，以SEQ ID No:02为上游引物，以SEQ ID No:03为下游引物，以退火温度59～61
℃，循环数为4～6进行DNA文库的构建；
[0016]2)转录为RNA文库：取部分步骤1)得到的DNA文库，在36～38℃转录反应1～3h得到RNA文库。
[0017]更具体地，所述步骤二包括：
[0018]1)RNA文库与Oligo连接：按RNA与如SEQ ID No:04所示的Oligo序列的比值为1:1.5～2.5的比例，将RNA文库与Oligo序列在64～66℃热激4～6min后，20～22℃结合28～32min，得到RNA
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Oligo复合物；
[0019]2)链霉亲和素磁珠与Oligo连接：将RNA
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Oligo复合物与链霉亲和素磁珠在22～24℃下孵育0.5～1.5h；
[0020]3)洗脱非特异性的序列：清洗与RNA
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Oligo复合物孵育后的链霉亲和素磁珠，除去没有被Oligo抓住的序列以及在未加入目标分子之前即发生自我剪切的序列，得到固定于链霉亲和素磁珠的RNA文库。
[0021]更具体地，所述步骤三包括：
[0022]1)加入目标分子L
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别异亮氨酸：向步骤二得到的固定于链霉亲和素磁珠的RNA文库中加入目标分子并进行孵育，通过逐轮缩短孵育时间得到具有高结合效率的适配体；可以与目标分子结合的序列从链霉亲和素磁珠上断裂下来，而不与目标分子结合的序列留在链霉亲和素磁珠上；
[0023]2)RT
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PCR和转录：将可以与目标分子结合的序列经RT
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PCR和转录后，得到新一轮筛选所需要的RNA文库；随后重复步骤二和步骤三，从而实现适配体序列的富集。
[0024]更具体地，所述步骤四包括：
[0025]1)以步骤三的产物作为模板，以SEQ ID No:05为上游引物、以SEQ ID No:06为下游引物进行建库，建库的下游引物还包括索引序列SEQ ID No:07；
[0026]2)纯化步骤1)的产物后进行Illumina二代测序，得到具体的适配体序列信息。
[0027]本专利技术的一个具体技术方案是：采用Hammerhead Ribozyme(锤头状核酶，简称HHR)，将HHR的茎Ⅱ全部替换成70个随机碱基N(记为N
70
)，用以产生与特定Ligand(配体)结合的适配体。人为的在HHR的3'段延伸19nt长度的碱基，其作用是后续加上一段与其互补的Oligo，此Oligo用生物素修饰(以下称为Oligo)，生物素修饰的目的是为后续整个文库被链霉亲和素化的磁珠(以下称为Beads)所固定。当核酶的茎被破坏后，其稳定性降低，不能发生剪切；而当小分子加入后，与随机序列结合后发生构象改变，核酶恢复完整结构发生剪切，导致核酶3'端剪切位点的几个碱基留在Beads上，而能与目标小分子结合的序列被留在上清中，通过RT
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PCR&Transcription反应得到新的RNA文库，即可进行新一轮的筛选。
[0028]本专利技术的目的另一方面，是提出了一种能与L
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别异亮氨酸结合的适配体，所述适配体的序列如SEQ ID No:08或SEQ ID No:09所示。
[0029]本次筛选所用的目标小分子L
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别异亮氨酸是枫糖尿病的特异性产物，在正常人血液中别异亮氨酸的量极少，而在枫糖尿病中则明显升高，因此测定血液中别异亮氨酸水平对于枫糖尿病来说具有临床诊断参考意义。由于枫糖尿病是一种遗传性疾病，出生后即可发病，而婴幼儿无法沟通病情，再加上目前前期的诊断十分困难，所以需要一种快速有效的诊断方法。本专利技术发现的一种能与L
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别异亮氨酸结合的适配体非常适合用于此病的发现和辅助诊断，该适配体可以探测极少量的配体，所以本专利技术发现了能与L...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适配体筛选方法，其特征在于：将工具酶中不影响剪切位点的原始序列替换为随机序列，使得工具酶结构被破坏不能发生剪切，由此构建文库；加入目标分子后，目标分子与随机序列结合并发生构象改变，使工具酶恢复完整结构并发生自我剪切；以工具酶发生剪切作为过滤筛选条件，进而通过若干轮筛选富集，得到可与目标分子结合的适配体。2.根据权利要求1所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述工具酶包括核酶或DNA酶中的至少一种。3.根据权利要求2所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述核酶包括锤头状核酶。4.根据权利要求3所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述目标分子包括L
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别异亮氨酸。5.根据权利要求4所述的适配体筛选方法，其特征在于：包括：步骤一，以锤头状核酶的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列作为模板建立DNA文库后，转录为所需要的RNA文库；步骤二，固定RNA文库于磁珠上；步骤三，加入目标分子并孵育，经过筛选富集得到与目标分子结合的适配体；步骤四，测序得到适配体的序列。6.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤一包括：1)构建DNA文库：取锤头状核酶的茎Ⅱ被随机序列替代后的序列SEQ ID No:01作为模板，以SEQ ID No:02为上游引物，以SEQ ID No:03为下游引物，以退火温度59～61℃，循环数为4～6进行DNA文库的构建；2)转录为RNA文库：取部分步骤1)得到的DNA文库，在36～38℃转录反应1～3h得到RNA文库。7.根据权利要求5所述的适配体筛选方法，其特征在于：所述步骤二包括：1)RNA文库与Oligo连接：按RNA与如SEQ ID No:04所示的Oligo序列的比值为1:1.5～2.5的比例，将RNA文库与Oligo序列在64～66℃热激4～6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李三暑，段安琪，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：