本发明专利技术公开了一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，所述一步成苗培养基以ＭＳ培养基为基础培养基，并在１Ｌ?ＭＳ培养基中，补加不同浓度和组合的６－苄氨基嘌呤，萘乙酸和２，４－二氯苯氧乙酸，而后经愈伤组织诱导直接分化不定芽和不定根，一步获得马铃薯再生植株。本发明专利技术无需将初代培养基中诱导获得的愈伤组织转接于分化培养基中再生成苗，与离体培养多步再生成苗相比，其步骤简化，培养周期短，重复性好，成苗率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种马铃薯离体培养一步成苗培养基，应用该培养基使马铃薯试管苗叶片一步成苗的方法，相应地，本专利技术也提供了一种优化该培 养基的方法。
技术介绍
马铃薯(Sola皿n tuberosum L.)是重要的粮、菜、饲料和工业原料兼农作物，在我 国农业生产中占有相当重要的地位。为了创新种质资源，组织培养技术被广泛的应用于马 铃薯育种研究中，并取得了显著成果。 植物组织培养一般是采用脱分化、再分化芽和生根壮苗等几个培养程序，称为多 步成苗。为了简化培养程序，提高培养效率，人们研究建立了一种一步成苗的新方法。一 步成苗又称一次成苗或直接成苗，是指外植体在一种培养基上同时完成脱分化和再分化过 程，直接分化出完整植株的培养方法。组织培养一步成苗，已在烟草、小麦、水稻、大豆、棉 花、辣椒等方面均有报道。目前以马铃薯叶片、茎段、叶柄、根等多种外植体进行了的再生植 株培养，均采用多步成苗培养。其具体技术实施方案为将马铃薯试管苗的叶片、茎段、叶 柄、根等的外植体进行愈伤组织培养，诱导30d左右后进行愈伤组织的继代培养，再将愈伤 组织转接分化培养基中再生植株，多步培养途径烦琐、再生率普遍较低且诱导时间较长。该 一步成苗方法具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，易操作，培养程序简单等优点，马 铃薯离体培养一步成苗未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的一个目的是优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，提高了马铃薯试管苗叶片愈伤组织的再生效率、縮短了培养时间、简化了操作步骤，为马铃薯优良种苗复壮快繁和品种改良提供了一条有效途径。 本专利技术的另一 目的是提供一种马铃薯离体培养一步成苗培养基。 本专利技术的再一目的是利用上述马铃薯离体培养一步成苗培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养方法。 本专利技术是通过如下技术方案实现的一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的 方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，包括以下步骤 (1)以不加任何激素的MS培养基作为对照，采用三因素三水平的L9(34)正交试 验设计，在MS培养基中，添加不同浓度的e-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的 不同组合，配制成马铃薯离体培养一步成苗培养基，其中6-苄氨基嘌呤浓度为1.5mg/L、 2. 0mg/L和2. 5mg/L，萘乙酸浓度为0. lmg/L、0. 2mg/L和0. 4mg/L， 2， 4- 二氯苯氧乙酸浓度 为0. Omg/L、0. lmg/L和0. 2mg/L ;将所得的不同激素组合的培养基置于培养瓶中； (2)将马铃薯试管苗叶片接种在步骤(1)所述不同激素组合的培养基中；3 (3)将步骤(2)所得的接种后培养基置于温度为22士2t:条件下，全黑暗培养7 10天后进行16h/d光照培养，光强为20001x ; (4)光照培养20d后，统计愈伤组织诱导率及愈伤组织的形成情况，光照培养40d 后统计愈伤组织分化率及成苗状况； (5)分析步骤(4)所得的实验数据，以质优、量多、高分化率及成苗状况良好所对 应的愈伤组织诱导培养基为优化的培养基。 —种马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯试管苗叶片一步成苗离体培养，所述一步 成苗培养基以MS培养基为基础培养基，并在1L MS培养基中，还需补加如下组分，并使各组 分的终浓度如下 度为: 6_苄氨基嘌呤 1. 5 2. 5mg/L ;萘乙酸 0. 1 0. 4mg/L;2，4-二氯苯氧乙酸 0 0. lmg/L。较佳地，所述的马铃薯一步成苗培养基，以1L MS培养基计，补加的各组分的终浓6_苄氨基嘌呤 2. 0mg/L ;萘乙酸 0.4mg/L。利用所述的马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培 养方法，包括如下步骤 (1)、提供所述马铃薯离体培养一步成苗培养基，并进行灭菌处理； (2)、选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片约0. 5cmX0. 5cm，以叶片背面贴于步骤(1)所述的培养基上； (3)、将步骤(2)所得的接种后培养基置于温度为22士2t:条件下，全黑暗培养， 7 10天后进行16h/d光照培养，光强为20001x ; (4)、光照培养40d后，得马铃薯再生植株。 本专利技术的有益效果为本专利技术所述的马铃薯离体培养一步成苗培养基和应用该培 养基使马铃薯试管叶片离体培养一步成苗的方法，叶片外植体在形成愈伤组织后，不需要 转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，该方法具有再生周期短，繁殖系数 和再生频率高，易操作，培养程序简单等优点，为马铃薯优良种苗快速繁殖及品种改良提供 一条有效途径。具体实施例方式以下将结合具体实施例对本专利技术做进一步描述和说明。 本试验以川芋IO号马铃薯品种的脱毒试管苗为供试材料，由四川农业大学农学院马铃薯研究与开发中心提供。 MS培养基由成都科龙化工试剂厂生产； 萘乙酸(NAA) ，6-苄氨基嘌呤(6-BA) ，2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)均为市售分析 纯化学试剂。 所需激素的配制方法6-苄氨基嘌呤(6-BA):配制浓度为lmg/ml，称取0. lg 6-苄氨基嘌呤用少许4INHCL溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用； 萘乙酸(NAA):配制浓度为0. 5mg/ml，称取0. 05g萘乙酸用少许无水乙醇溶解后用 蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用； 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D):配制浓度为lmg/ml，称取0. lg 2，4-二氯苯氧乙酸 用少许IN HCL溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用。 实施例1 : —种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片 离体培养一步成苗，包括以下步骤 以不加任何激素的MS培养基作为对照，采用三因素三水平的L9(34)正交试验设 计，在MS培养基中添加不同浓度和组合的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2， 4- 二氯苯氧乙酸，配 制成10组不同的马铃薯一步成苗培养基。各组中，含有的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二 氯苯氧乙酸的浓度及组合见表1 表1具有不同激素组合物的马铃薯一步成苗培养基正交实验设计L9(34)<table>table see original document page 5</column></row><table> 对上述10种马铃薯一步成苗培养基进行灭菌处理，并取适量置于培养瓶中； 选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片，并切 取约0. 5cmX0. 5cm大小叶片，以叶片背面贴于所述马铃薯一步成苗培养基上；每瓶接种 6个外植体，每个组合接种8瓶；接种后培养基置于温度为22士2t:条件下，全黑暗培养， 7-10天后进行16h/d光照培养，光强为20001x ;光照培养20d后，由表2可知愈伤组织诱 导率，即产生愈伤的外植体数/接种外植体数X100X，及愈伤组织的形成情况。在原培养 基中继续光照培养40d后得愈伤组织分化结果(见表3)，即分化芽的愈伤块数/总愈伤块 数X10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，其特征在于，包括以下步骤：（１）以不加任何激素的ＭＳ培养基作为对照，采用三因素三水平的Ｌ↓［９］（３↑［４］）正交试验设计，在ＭＳ培养基中，添加不同浓度的６－苄氨基嘌呤、萘乙酸和２，４－二氯苯氧乙酸的不同组合，配制成马铃薯离体培养一步成苗培养基，其中６－苄氨基嘌呤浓度为：１．５ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ和２．５ｍｇ／Ｌ，萘乙酸浓度为：０．１ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌ和０．４ｍｇ／Ｌ，２，４－二氯苯氧乙酸浓度为：０．０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ和０．２ｍｇ／Ｌ；将所得的不同激素组合的培养基置于培养瓶中；（２）将马铃薯试管苗叶片接种在步骤（１）所述不同激素组合的培养基中；（３）将步骤（２）所得的接种后培养基置于温度为２２±２℃条件下，全黑暗培养７～１０天后进行１６ｈ／ｄ光照培养，光强为２０００ｌｘ；（４）光照培养２０ｄ后，统计愈伤组织诱导率及愈伤组织的形成情况，光照培养４０ｄ后统计愈伤组织分化率及成苗状况；（５）分析步骤（４）所得的实验数据，以愈伤组织诱导率高及愈伤组织的形成情况良好，愈伤组织分化率高及成苗状况良好所对应的培养基为优化的培养基。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王西瑶，倪苏，黄雪丽，刘帆，杨先泉，王俊，胡小弦，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：51[中国|四川]
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