【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学诊断，尤其涉及一种基于crispr-cas13a检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)作为线性单股正链rna病毒，基因组约28kb，属于尼多病毒目，冠状病毒科，α冠状病毒亚科，引起猪的流行性腹泻疾病(porcine epidemic diarrhea，ped)。猪流行性腹泻病毒是一种重要的病原，于1971年首次发现于英国，1978年，在比利时分离到类似冠状病毒的病原cv777，后被证明分离的病毒为ped。1982年ped首次在亚洲被报道，与欧洲当时的情况相比，ped在亚洲流行更为严重。尤其是2010年以来，随着新型pedv变异毒株的出现，中国、韩国、日本等亚洲国家相继暴发了严重的ped，哺乳仔猪的致死率可高达100％，ped对亚洲养猪业产生了越来越大的影响。目前对于pedv的最常用检测方法主要有rt-pcr、rt-qpcr、以及elisa，除此之外也开发了rt-lamp、nano pcr、rpa等较为先进的检测技术，但是这些检测技术很难兼顾时间成本、经济成本、灵敏度、和特异性。而cripsr/cas13a作为目前较新的检测技术，在被证明其可行性、高特异性、高灵敏度及可靠性之后，成为目前热门的分子生物学检测技术研究领域。如果将cripsr/cas13a技术用于pedv的检测，将会加强我们对该病毒的监测和控制。
2、crispr/cas13a(clustered regularly inte
3、pedv是危害全球养猪业的重要传染病，在我国很多猪场流行，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前对于其检测主要依赖于rt-pcr以及rt-qpcr技术，对检测环境要求较高，操作较为复杂，且rt-pcr的检测灵敏度较低，实际检测中可能会出现漏检的情况。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的crrna分子，所述crrna分子的序列如seq id no.13所示。
2、本专利技术的目的之二在于提供一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的试剂，所述试剂中含有上述crrna分子。
3、本专利技术的目的之三在于提供一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的产品，所述产品中含有上述试剂。
4、优选地，所述产品为试剂盒。
5、更优选地，所述试剂盒中还含有cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物；所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别如seq id no.2、3所示。
6、更优选地，所述rna探针的序列为5’-uuuuuu-3’。
7、本专利技术的目的之四在于提供上述crrna分子或上述试剂在制备crispr-cas13a检测猪流行性腹泻病毒核酸产品中的用途。
8、优选地，所述产品为试剂盒。
9、本专利技术的目的之五在提供一种应用上述crrna分子基于非诊断目的的crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
10、(1)制备样本核酸模板；
11、(2)使步骤(1)获得的核酸模板、cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，以及所述crrna分子在crispr-cas13a反应体系里反应；
12、(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。
13、优选地，步骤(1)中所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。
14、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
15、本专利技术以rt-raa技术和crispr-cas13a技术结合，实现对pedv临床样本的高灵敏度、低复杂性的可视化检测。本专利技术还提供了一种操作简单、检测灵敏、结果可视化的检测试剂盒，从而为提高生猪养殖行业检测pedv，降低生物安全风险提供了技术手段。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于CRISPR-Cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的crRNA分子，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.13所示。
2.一种用于CRISPR-Cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1中所述的crRNA分子。
3.一种用于CRISPR-Cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求2中所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中还含有Cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的RNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物；所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2、3所示。
6.根据权利要求5中所述的产品，其特征在于，所述RNA探针的序列为5’-UUUUUU-3’。
7.权利要求1中所述的crRNA分子或权利要求2中所述的试剂在制备CRISPR-Cas13
8.根据权利要求7中所述的用途，其特征在于，所述产品为试剂盒。
9.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。
...【技术特征摘要】
1.一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的crrna分子，其特征在于，所述crrna分子的序列如seq id no.13所示。
2.一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1中所述的crrna分子。
3.一种用于crispr-cas13a技术检测猪流行性腹泻病毒核酸的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求2中所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂盒中还含有cas13a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物和下游引物；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，刘哲言，朱玲，曾秀，葛良鹏，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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