一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法

【技术实现步骤摘要】
一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学和再生医学领域，涉及一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法
、
产品及应用
。

技术介绍

[0002]纤维软骨是一种介于透明软骨与致密结缔组织之间的一种过渡形式的组织，主要分布于椎间盘
、
关节软骨盘
、
耻骨联合和肌腱关节囊韧带附着部分
。
纤维软骨由软骨细胞
、
成纤维细胞和软骨基质
(
蛋白聚糖和胶原纤维
)
构成，在体内主要起对抗压力和应力的功能
。
然而，由于纤维软骨组织缺乏血管，组织受损后难以修复
。
[0003]纤维软骨细胞因其能够形成软骨组织以及合成和分泌软骨基质成分
(
如胶原蛋白和硫酸软骨素
)
等特性而成为修复膝关节半月板候选细胞类型
。
自体纤维软骨组织
(
或细胞
)
移植
、
手术修复是当前治疗成人致密结缔组织
(
包括肌腱
、
韧带
、
半月板和纤维环
)
损伤的主要方法
。
大量临床研究证实，这些致密结缔组织损伤后的愈合效果很不理想，主要是由于自体纤维软骨细胞在体外增殖和再生能力较弱，
ECM
合成和分泌较少，难以实现快速有效的修复
。
此外，自体取材也会造成自身机体创伤和感染，而同种异位软骨的移植则无法发挥有效的对抗压力和应力的功能
。
因此，需要开发新的方法来大量获取高再生能力的纤维软骨细胞，用于开发这些致密结缔组织再生修复的潜在疗法
。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了以下实施方案：
[0005]本专利技术提供了一种产品，所述产品用于制备高再生传代能力的纤维软骨细胞；所述产品包括培养基
1、
培养基
2、
培养基3和
/
或培养基4；其中，所述培养基1是含有
Rocki
的
E8
完全培养基，所述培养基2是含有
LDN193189
的
E8
完全培养基，所述培养基3是含有
LDN193189、CHIR
和
AGN193109
的
E8
完全培养基，所述培养基4是含有
ITS
‑
G、PUNO1
‑
TGF
‑
β
3、SAG、FGF
‑2和
AGN193109
的
DMEM/F12
营养液
。
[0006]进一步，所述培养基1中的组分
Rocki
的浓度为
10
μ
M。
[0007]进一步，所述培养基2中的组分
LDN193189
的浓度为
250nM。
[0008]进一步，所述培养基3中的组分
LDN193189
的浓度为
250nM。
[0009]进一步，所述培养基3中的组分
CHIR
的浓度为5μ
M。
[0010]进一步，所述培养基3中的组分
AGN193109
的浓度为
100nM。
[0011]进一步，所述培养基4中的组分
ITS
‑
G
的质量百分比为1％
。
[0012]进一步，所述培养基4中的组分
PUNO1
‑
TGF
‑
β3的浓度为
10ng/ml。
[0013]进一步，所述培养基4中的组分
SAG
的浓度为
300nM。
[0014]进一步，所述培养基4中的组分
FGF
‑2的浓度为
20ng/ml。
[0015]进一步，所述培养基4中的组分
AGN193109
的浓度为
100nM。
[0016]术语“培养物”是指细胞
、
生物体
、
多细胞实体或组织在培养基中的生长
。
术语“培
养”是指实现此类生长的任何方法，并且可包括多个步骤
。
术语“进一步培养”是指将细胞
、
生物体
、
多细胞实体或组织培养至某一生长阶段，然后使用另一种培养方法使所述细胞
、
生物体
、
多细胞实体或组织达到另一生长阶段
。“细胞培养物”是指细胞在体外的生长
。
在这样的培养中，细胞增殖，但它们本身不组织成组织
。“组织培养物”是指组织的维持或生长，例如器官原基或成体器官的体外外植体，以便保持其结构和功能
。“单层培养物”是指这样的培养物，其中细胞在合适的培养基中繁殖，且大部分彼此连接并粘附到基底上
。
此外，“悬浮培养物”是指这样的培养物，其中细胞在合适的培养基中繁殖，且悬浮于该合适的培养基中
。
[0017]术语“培养基”或“培养液”是本领域公认的，并且通常是指用于培养活细胞的任何物质或制备物
。
如在提及细胞培养中所使用的术语“培养基”包括细胞周围环境的组分
。
培养基可以是固体
、
液体
、
气体或相和材料的混合物
。
培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基
。
培养基还包括凝胶状培养基，例如琼脂
、
琼脂糖
、
明胶和胶原基质
。
术语“培养基”还指意图用于细胞培养的材料，即使其尚未与细胞接触
。
换言之，准备用于细菌培养的营养丰富的液体是培养基
。
[0018]在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基1，其组分为
10
μ
M Rocki
的
E8
完全培养基
。
在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基2，其组分为
250nM
的
LDN193189
的
E8
完全培养基
。
在某些具体的实施方案中，所述制备高再生传代能力的纤维软骨细胞的产品包括培养基3，其组分为
250nM LDN193189、5
μ
M CHIR、100nM AGN193109
的
E8
完全培养基
。
在某些具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种产品，其特征在于，所述产品用于制备高再生传代能力的纤维软骨细胞；所述产品包括培养基
1、
培养基
2、
培养基3和
/
或培养基4；其中，所述培养基1是含有
Rocki
的
E8
完全培养基，所述培养基2是含有
LDN193189
的
E8
完全培养基，所述培养基3是含有
LDN193189、CHIR
和
AGN193109
的
E8
完全培养基，所述培养基4是含有
ITS
‑
G、PUNO1
‑
TGF
‑
β
3、SAG、FGF
‑2和
AGN193109
的
DMEM/F12
营养液
。2.
根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述培养基1中的组分
Rocki
的浓度为
10
μ
M
；优选地，所述培养基2中的组分
LDN193189
的浓度为
250nM
；优选地，所述培养基3中的组分
LDN193189
的浓度为
250nM
；优选地，所述培养基3中的组分
CHIR
的浓度为5μ
M
；优选地，所述培养基3中的组分
AGN193109
的浓度为
100nM
；优选地，所述培养基4中的组分
ITS
‑
G
的质量百分比为1％；优选地，所述培养基4中的组分
PUNO1
‑
TGF
‑
β3的浓度为
10ng/ml
；优选地，所述培养基4中的组分
SAG
的浓度为
300nM
；优选地，所述培养基4中的组分
FGF
‑2的浓度为
20ng/ml
；优选地，所述培养基4中的组分
AGN193109
的浓度为
100nM。3.
一种高再生传代能力的纤维软骨细胞的分化方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)
将
iPS
细胞消化成单细胞，离心并使用权利要求1或2所述的培养基1重悬，接种到低吸附培养皿上过夜形成
EB
球；
2)
更换权利要求1或2所述的培养基2诱导培养2天；
3)
接种于基质胶包被板中，更换权利要求1或2所述的培养基3培养4天；
4)
更换权利要求1或2所述的培养基4，培养6天，分化结束
。4.
根据权利要求3所述的分化方法，其特征在于，所述分化方法步骤
1)
中
iPS
细胞消化使用的试剂为
Tryp.LE
；优选地，所述
iPS
细胞为
hiPSCs
；优选地，所述步骤
1)
消化成的单细胞的浓度为
1.5
×
106cells/mL
；优选地，所述步骤
1)
接种的培养皿为低吸附孔板；优选地，所述步骤
3)
接种基质胶包被板为
Matrigel
‑
coated
的
12
孔板
。5.
一种纤维软骨细胞，其特征在于，所述纤维软骨细胞由权利要求3或4所述的分化方法制备得到
。6.
一种
10

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋宗敏，任文文，刘子嶷，顾雨春，吴理达，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：