一种外周血来源的制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向

【技术实现步骤摘要】
一种外周血来源的CAR
‑
NK的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地涉及一种外周血来源的
CAR
‑
NK
细胞的制备方法
。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞
(natural killer cell
，
NK)
是机体内一类重要的免疫细胞，是固有免疫系统
(Innate immune system)
的重要组成成分，是人体内抵挡病原入侵和恶性肿瘤第一道防线的重要组成之一
。NK
细胞杀伤靶细胞是抗原非特异性的，无主要组织相容性复合体
(MHC)
限制，异体
NK
细胞移植不会引起抗宿主反应
(GVHD)。NK
细胞的来源广泛，如
NK
肿瘤细胞系
(NK
‑
92、NKL
等
)、
外周血
NK
细胞
(PB
‑
NK)、
脐带血
NK
细胞
(UCB
‑
NK)、
干细胞诱导分化
NK
细胞
(
造血干细胞
、
诱导多能干细胞
)。
在正常人的外周血中，
NK
细胞约占循环淋巴细胞的5％
‑
15
％
。
外周血来源的
NK
细胞经培养扩增后可以大量制备，从而满足大剂量的临床应用
。
[0003]嵌合抗原受体
(Chimeric antigen receptor
，
CAR)T
细胞在治疗耐药
、
复发
、
难治的
B
细胞肿瘤领域，如白血病和淋巴瘤，取得了突破性进展，但
CAR
‑
T
疗法在实体瘤中的治疗效果并不像治疗血液肿瘤那样显著
。
基于
NK
细胞的肿瘤杀伤能力，利用较成熟的
CAR
技术修饰
NK
细胞可以进一步增强
NK
细胞的肿瘤靶向和裂解杀伤能力，
CAR
‑
NK
的研究具有很大的临床意义
。
[0004]表皮生长因子受体
(Epidermal Growth Factor Receptor
，
EGFR)
是酪氨酸激酶亚家族的成员，通过与其配体结合可诱导
EGFR
同二聚化或异二聚化，促使其酪氨酸激酶结构域自磷酸化，进一步激活下游信号通路
(
如：
PI3K/AKT
信号通路，
Ras/Raf/MEK/ERK
信号通路
)
，行使其生物学功能
。
很多肿瘤中过度表达
EGFR
，包括膀胱癌
、
脑癌
、
头颈癌
、
胰腺癌
、
肺癌
、
乳腺癌
、
卵巢癌
、
结肠癌
、
前列腺癌和肾癌等，
EGFR
也表达于正常组织中，皮肤
、
肝脏和胃肠道的上皮组织中表达量较高，但表达水平远低于肿瘤组织
。
大概有
30
％的胶质母细胞瘤携带表皮生长因子受体突变
(Epidermal growth factor receptor variant III
，
EGFRvIII)
，
EGFRvIII
是由野生型
EGFR(Wildtype EGF
，
EGFR
或
wtEGFR)
基因突变而产生的肿瘤特异性的突变，属于肿瘤新生抗原
(neo
‑
antigen)
，这个突变不仅有非常好的免疫原性，易于激活免疫反应，而且正常的细胞和组织都不表达这个蛋白
。
因此开发能够同时靶向
EGFR
和
EGFRvIII
的
CAR
‑
NK
细胞在相关实体瘤的治疗领域有很深的临床应用前景
。
[0005]当前
CAR
‑
NK
细胞临床试验多使用
NK92
细胞系，可连续传代培养，易于转染
。
但作为肿瘤细胞系的
NK92
细胞具有固有缺陷，包括潜在的致瘤风险等，因此不是最理想细胞来源
。
[0006]PBMC
是原代
NK
细胞重要来源，细胞毒性强，但增殖能力较弱，较难转染
。
[0007]对于
NK
细胞，特别是外周血来源的
NK
细胞来说，由于其难转染的特性，
CAR
‑
NK
的制备效率远低于
CAR
‑
T
，这也限制了
CAR
‑
NK
的临床应用
。
因此，
CAR
‑
NK
细胞高效制备方法的开发具有较高的临床价值
。
[0008]因此，本领域迫切需要开发新的靶向
EGFR
的外周血来源
CAR
‑
NK
细胞的制备方法
。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种靶向
EGFR
的
CAR
‑
NK
细胞的制备方法
。
[0010]具体地，本专利技术提供了一种用于制备靶向
EGFR
的
CAR
‑
NK
细胞病毒包装体系及重组病毒载体，及其用于制备靶向
EGFR
的
CAR
‑
NK
细胞的方法
。
[0011]在本专利技术的第一方面，提供了一种病毒包装体系，所述病毒包装体系包含目的基因表达质粒
、
病毒包膜蛋白质粒和辅助包装质粒，
[0012]其中，所述目的基因表达质粒选自：
pMSCV、pMX、pMY、pLenti、
或其组合，并且，所述目的基因表达质粒表达靶向
EGFR/EGFRvIII
的嵌合抗原受体
(CAR)
或含有所述嵌合抗原受体的融合蛋白
。
[0013]在另一优选例中，所述靶向
EGFR/EGFRvIII
的
CAR
的氨基酸序列如
SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种病毒包装体系，其特征在于，所述病毒包装体系包含目的基因表达质粒
、
病毒包膜蛋白质粒和辅助包装质粒，其中，所述目的基因表达质粒选自：
pMSCV、pMX、pMY、pLenti、
或其组合，并且，所述目的基因表达质粒表达靶向
EGFR/EGFRvII I
的嵌合抗原受体
(CAR)
或含有所述嵌合抗原受体的融合蛋白
。2.
如权利要求1所述的病毒包装体系，其特征在于，所述的病毒包膜蛋白质粒选自：
pCMV
‑
Vsvg、pCMV
‑
RD114A、pCMV
‑
BaEV
‑
TR、pCMV
‑
Ampho、pCMV
‑
10A1、
或其组合
。3.
如权利要求1所述的病毒包装体系，其特征在于，所述的辅助包装质粒选自：
psPAX2、pCMV
‑
gag
‑
pol、
或其组合
。4.
如权利要求1所述的病毒包装体系，其特征在于，所述目的基因表达质粒为5’
LTR
启动子自失活型
pLenti
；且所述辅助包装质粒为
psPAX2。5.
如权利要求1所述的病毒包装体系，其特征在于，所述目的基因表达质粒选自：
pMSCV、pMX、pMY、
或其组合；且所述辅助包装质粒为
pCMV
‑
gag
‑
pol。6.
如权利要求1所述的病毒包装体系，其特征在于，所述的所述的病毒包装体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶平冬，戴朝辉，王颖慧，张格，刘步青，韩烨，
申请(专利权)人：上海怀越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：